一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用制造技术

本发明专利技术公开了一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用，通过二元组装制备具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料的方法分为两步：首先制备纳米羟基磷灰石；在胶原矿化过程中通过透析缓慢进入并沉积于胶原纤维表面；在体外通过各项参数的控制完成对天然骨矿化胶原纤维的模拟；再完全复制天然骨化学成分及周期性等级结构的前提下，三维矿化胶原支架具有合适的机械强度，能够招募宿主细胞实现成骨分化。具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料还具备优良的成血管能力，不加任何生物制剂如成骨因子或重组蛋白的情况下，单独利用三维多孔胶原支架材料实现活体动物试验中骨缺损的修复。

A three-dimensional mineralized collagen scaffold material and its application in bone regeneration

The invention discloses a three-dimensional mineralized collagen scaffold material and its bone regeneration application. The method of preparing three-dimensional mineralized collagen scaffold material with strict grade structure by binary assembly is divided into two steps: first, nano-hydroxyapatite is prepared; during the process of collagen mineralization, it enters slowly and deposits on the surface of collagen fibers through dialysis; In vitro, the natural bone mineralized collagen fibers were simulated by controlling various parameters, and then the chemical composition and periodic hierarchical structure of natural bone were completely replicated. Under the premise of proper mechanical strength, the three-dimensional mineralized collagen scaffolds could recruit host cells to achieve osteogenic differentiation. Three-dimensional mineralized collagen scaffolds with strict hierarchical structure also have excellent angiogenesis ability. Without any biological agents such as osteogenic factors or recombinant proteins, three-dimensional porous collagen scaffolds can be used to repair bone defects in vivo animal experiments.

【技术实现步骤摘要】
一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用
本专利技术涉及骨组织修复材料制备与治疗领域，具体是一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用。
技术介绍
传统意义上通常以生物材料结合成骨细胞及成骨蛋白为一种强有力的手段来修复骨缺损，这种方法的缺点是高成本和伴随着外源性细胞和生长因子带来的副作用，如呼吸效应、异位骨形成、移植点的原位骨吸收，及可能导致的癌症发病率增高等。因此开发利用身体自主再生能力，通过召集宿主细胞来诱导骨形成的骨诱导型生物材料仍然是临床亟待解决的问题。而这项技术的关键在于发展一种目标特异性的生物支架材料以模拟天然骨的等级结构和表面形貌为招募宿主细胞提供合适的微环境，最终完成从结构到功能上的骨再生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种三维矿化胶原支架材料的制备方法，包括以下步骤：1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织；常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L；将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物；在粗提物中加入NaCl进行盐析，分离出沉淀再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于透析袋中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl2·2H2O及25mg的聚丙烯酸溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液；将48mg的K2HPO4·3H2O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液；在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中；反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，8000～12000r/min离心5～10分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mL的灭菌PBS溶液，使其pH＝7.4，震荡使其完全溶解；3)胶原矿化：取一定量的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，并放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤2)所得的羟基磷灰石的PBS溶液中；在湿润的环境中于37℃下透析六天，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；4)三维多孔框架的合成：将步骤3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用重量比1％的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)在80％的乙醇中进一步交联4小时，随后用甘氨酸溶液与去离子水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。作为本专利技术进一步的方案：在步骤1)中，胶原来源为动物的皮及肌腱组织。作为本专利技术进一步的方案：在步骤2)中，根据中间体自由能的计算得出聚丙烯酸的分子量区间在1720～2265之间，浓度在0.1～100mg/mL之间。作为本专利技术进一步的方案：在步骤2)中，A液的CaCl2浓度为1～100mM，聚丙烯酸的质量浓度为0.1～100mg/mL；B液的K2HPO4浓度为1～100mM；A液与B液的体积比为1：10～10：1。作为本专利技术进一步的方案：在步骤2)中，TBS缓冲液的配制方法为：2.42g的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和8g的NaCl溶于1L的去离子水中，最后用HCl调节溶液pH为7.4。作为本专利技术进一步的方案：在步骤3)中，所述的I型胶原的浓度为0.1～10mg/mL，透析环境中羟基磷灰石的质量为0.1～100mg。作为本专利技术进一步的方案：在步骤4)中，所述的EDC溶液的配置方法为：将1g的EDC加入到99mL80％乙醇中，使其质量百分数为1％，甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法得到的具严格等级结构的三维矿化胶原支架。作为本专利技术进一步的方案：所述的具严格等级结构的三维矿化胶原支架在制备骨组织修复材料中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术中胶原分子可以在K+及碱性环境中纤维化组装为三维支架，纳米羟基磷灰石能通过透析袋进入到胶原体系中进行共组装并在胶原纤维内部有序排列，形成具严格等级性拓补结构的三维胶原支架材料，该材料能通过改变干细胞共价锚定密度来调节干细胞分化。组织工程学要求生物材料需要具备的首要条件是有良好的生物相容性，细胞与材料间具备良好的相互作用以促进新骨再生，HIMC能提供与天然骨类似的微环境便于细胞的生长及分化，在小鼠和小型猪的临界骨缺损模型中，HIMC可在无成骨细胞和成骨因子存在下诱导大量新骨及骨髓血管的生长，再生效果堪比自体移植骨，HIMC为受损区域骨再生提供了新的设计和构建高度活性的骨组织修复材料的思路。该制备过程简便易行，绿色环保，有利于实现工业化大规模生产。附图说明图1为本专利技术中天然骨、HIMC及NIMC的形貌及扫描(SEM)和透射(TEM)电镜图。图2为本专利技术中天然骨、HIMC及NIMC的原子力显微镜(AFM)图及力学模式。图3为本专利技术中天然骨、HIMC及NIMC的的AFM力学形貌图和杨氏模量对比。图4为本专利技术在不同基底材料培养细胞增殖时间变化。图5为本专利技术中细胞染色实验确定不同基底上细胞形貌和分支点数目及纵横比。图6为本专利技术中不同基底上Runx2及VEGF表达，及不同基底上免疫荧光染色。图7为本专利技术中不同植入材料的形貌和micro-CT图像，及大鼠下颌骨修复手术模式。图8为本专利技术中不同植入材料的修复效果micro-CT图像及再生骨体积，HIMC材料可媲美DCBM材料；缺损区HE染色图像。图9为本专利技术中不同植入材料修复效果截面图，及大鼠下颌骨修复区的HE、Masson、TRAP染色图像。图10为本专利技术中不同植入材料修复区Runx2及CD31免疫染色图像及定量结果。图11为本专利技术中不同植入材料修复区Osx及VEGFR-1免疫组织化学染色图像。图12为本专利技术中小型猪颅骨缺损修复模式图。图13为本专利技术中术中缺损的建立和材料植入(a)；术后12周螺旋CT扫描，上面观(b)和前面观(c)。图14为本专利技术中术后12周缺损区分别植入HIMC及HA组的HE染色图，HIMC组明显有新骨形成及血管化，而HA组则有大量支架残留。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。材料及其购买来源：牛肌腱透析袋(3500Da，Invitrogen，Paisly，UK)PAA(M.W.2000)(Sigma-Aldrich，USA)磷酸缓冲液(Gibco，Invitrogen，Paisly，UK)甘氨酸(Sigma-Aldrich，USA)HA(东博生物科技有限公司，中国)本专利技术实施例中，具严格等级结构的三维矿化胶原支架(HIMC)的制备：实施例1(1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织，常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织；常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L；将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物；在粗提物中加入NaCl进行盐析，分离出沉淀再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于透析袋中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl2·2H2O及25mg的聚丙烯酸溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液；将48mg的K2HPO4·3H2O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液；在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中；反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，8000～12000r/min离心5～10分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mL的灭菌PBS溶液，使其pH＝7.4，震荡使其完全溶解；3)胶原矿化：取一定量的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，并放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤2)所得的羟基磷灰石的PBS溶液中；在湿润的环境中于37℃下透析六天，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；4)三维多孔框架的合成：将步骤3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用重量比1％的1‑乙基(3‑二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐在80％的乙醇中进一步交联4小时，随后用甘氨酸溶液与去离子水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。...

【技术特征摘要】
1.一种三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织；常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L；将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物；在粗提物中加入NaCl进行盐析，分离出沉淀再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于透析袋中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl2·2H2O及25mg的聚丙烯酸溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液；将48mg的K2HPO4·3H2O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液；在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中；反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，8000～12000r/min离心5～10分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mL的灭菌PBS溶液，使其pH＝7.4，震荡使其完全溶解；3)胶原矿化：取一定量的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，并放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤2)所得的羟基磷灰石的PBS溶液中；在湿润的环境中于37℃下透析六天，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；4)三维多孔框架的合成：将步骤3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用重量比1％的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐在80％的乙醇中进一...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘燕，周彦恒，罗聃，
申请(专利权)人：杭州恒睿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33