一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法技术

本发明专利技术公开了一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，包括喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备、荧光探针(CyQ‑Cys)溶液的制备、金属选择性实验、Fe

【技术实现步骤摘要】
一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法
本专利技术涉及黑茶抗氧化领域，尤其涉及一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法。
技术介绍
黑茶中的黄酮、儿茶素等抗氧化性物质能有效抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化活性，其测定方法主要有清除自由基能力法、氧化自由基吸收能力法及铁离子还原法。其中，Fe3+被抗氧化剂还原为Fe2+后，通过与三吡啶三嗪(TPTZ)络合引起吸光度的变化来检测抗氧化活性，但分光光度法的灵敏度偏低。因此，改进铁离子还原法，发展一种高灵敏、高特异性的荧光分析法检测黑茶的抗氧化活性将具有非常重要的意义。另一方面，金属离子可与生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)及半胱氨酸(Cys)分子中的羧基、氨基和巯基配位，通过改变检测体系的光学信号，实现对金属离子的检测，有效的利用上述原理可高选择性、快速识别Fe3+而不受Fe2+的干扰。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，具体包括以下步骤：S1、喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备：将4-甲基-N-乙基喹啉，N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠溶于乙醇中，在氮气保护下于80℃反应1h，冷却后，旋蒸除溶剂，然后在氯仿和醋酸钠溶液中搅拌1h，过滤，真空干燥，柱层析分离，得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，以4-甲基喹啉与二醛缩合剂反应得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，便于后续的使用；S2、荧光探针(CyQ-Cys)溶液的制备：喹啉基花菁类衍生物(CyQ)用N，N-二甲基甲酰胺配成10mol/L溶液，半胱氨酸(Cys)用去离子水配成200mmol/L溶液，在离心管中依次加入10mol/L的喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液，逐滴加入200mmol/L的半胱氨酸(Cys)溶液，10mmol/L、pH值为7的磷酸缓冲盐溶液，混合均匀后用N，N-二甲基甲酰胺稀释，反应3min，随后，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，通过卤素-巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ-Cys)母液；S3、金属选择性实验：金属盐用去离子水配成1.0mmol/L溶液备用。在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同量的不同金属离子溶液，反应3min后，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号变化，检测荧光探针(CyQ-Cys)用于Fe3+的特异性响应，尤其是，Fe3+与其它金属离子共存时，荧光探针(CyQ-Cys)的抗干扰能力；S4、Fe3+的检测测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同浓度的Fe3+溶液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，检测不同浓度的Fe3+溶液荧光强度相应的变化情况；S5、黑茶备用液的制取：称取未处理的安化黑茶和发酵后的安化黑茶于沸水中浸泡10min。残渣在加沸水浸泡2次，滤液合并后浓缩，然后加入容量瓶中，用蒸馏水定容，获得黑茶备用液；S6、黑茶备用液测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液和S5步骤中制取的黑茶备用液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化。优选的：在S1中，所述4-甲基-N-乙基喹啉，N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠的摩尔质量比为4∶1∶4，且所述柱层析分离的展开剂为甲醇和二氯甲烷，且所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1∶9。优选的：在S2中，所述喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液与磷酸缓冲盐溶液的体积比为1∶25。优选的：在S3中，所述金属盐采用Al3+、Fe2+、Cu2+，Zn2+，Hg2+，Pb2+，Mn2+，Ag+或Co2+金属盐设置。优选的：在S5中，所述安化黑茶、发酵后的安化黑茶和水的质量比为1∶1∶10。优选的：在S1-S6中，所述水均采用二次蒸馏水。优选的：在S2、S3、S4、S6中，所述发射光谱的测试条件：激发光和发射光的狭缝宽度均为10nm，电压为500V，激发波长为460nm，平行测试3次。该方法大大的有效改进铁离子还原法，发展一种高灵敏、高特异性的荧光分析法检测黑茶的抗氧化活性。本专利技术提供的一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，与现有技术相比，本专利技术的以4-甲基喹啉与二醛缩合剂反应得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，随后，喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与半胱氨酸(Cys)通过卤素-巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ-Cys)，而铁离子(Fe3+)可诱导荧光探针(CyQ-Cys)荧光信号明显增强，其荧光信号的变化与Fe3+浓度呈良好的线性关系，且荧光探针(CyQ-Cys)可快速(＜30s)、高特异性识别Fe3+而不受常见离子的干扰。利用黑茶中抗氧化活性物能还原铁离子而减弱检测体系的荧光恢复程度，构建了黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，并应用于实际样品分析，结果可靠，快捷灵敏。附图说明图1为本专利技术的喹啉类花菁染料合成路线示意图；图2为本专利技术的喹啉基花菁类衍生物(CyQ)添加前后半胱氨酸(Cys)的荧光发射光谱示意图；图3为本专利技术的不同浓度半胱氨酸(Cys)对喹啉基花菁类衍生物(CyQ)荧光强度变化的影响示意图；图4为本专利技术的添加Fe3+前后荧光探针(CyQ-Cys)的紫外-可见吸收光谱示意图；图5为本专利技术的添加Fe3+前后荧光探针(CyQ-Cys)的荧光发射光谱示意图；图6为本专利技术的pH值对Fe3+处理前后荧光探针(CyQ-Cys)的荧光强度的影响示意图；图7为本专利技术的Fe3+处理前后荧光探针(CyQ-Cys)的稳定性示意图；图8为本专利技术的荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+孵育的动力学曲线示意图；图9为本专利技术的不同离子孵育荧光探针(CyQ-Cys)的荧光发射光谱示意图；图10为本专利技术的Fe3+加入不同金属离子溶液前后荧光探针(CyQ-Cys)荧光强度的变化的荧光强度示意图；图11为本专利技术的不同浓度Fe3+对荧光探针(CyQ-Cys)的荧光发射光谱的影响示意图；图12为本专利技术的过量的Fe3+与荧光探针(CyQ-Cys)的荧光强度变化的线性关系示意图；图13为本专利技术的喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和N-乙酰基半胱氨酸(NAC)孵育后的荧光发射光谱示意图；图14为本专利技术的荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+的工作曲线示意图；图15为本专利技术的识别机理示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，具体包括以下步骤：S1、喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备：将4-甲基-N-乙基喹啉，N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠溶于乙醇中，在氮气保护下于80℃反应1h，冷却后，旋蒸除溶剂，然后在氯仿和醋酸钠溶液中搅拌1h，过滤，真空干燥，柱层析分离，得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，以4-甲基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备：将4‑甲基‑N‑乙基喹啉、N‑[(3‑(苯胺基亚甲基)‑2‑氯‑1‑环己烯‑1‑基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠溶于乙醇中，在氮气保护下于80℃反应1h，冷却后，旋蒸除溶剂，然后在氯仿和醋酸钠溶液中搅拌1h，过滤，真空干燥，柱层析分离，得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，以4‑甲基喹啉与二醛缩合剂反应得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，便于后续的使用；S2、荧光探针(CyQ‑Cys)溶液的制备：喹啉基花菁类衍生物(CyQ)用N，N‑二甲基甲酰胺配成10mol/L溶液，半胱氨酸(Cys)用去离子水配成200mmol/L溶液，在离心管中依次加入10mol/L的喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液，逐滴加入200mmol/L的半胱氨酸(Cys)溶液，10mmol/L、pH值为7的磷酸缓冲盐溶液，混合均匀后用N，N‑二甲基甲酰胺稀释，反应3min，随后，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，通过卤素‑巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ‑Cys)母液；S3、金属选择性实验：金属盐用去离子水配成1.0mmol/L溶液备用。在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ‑Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同量的不同金属离子溶液，反应3min后，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号变化，检测荧光探针(CyQ‑Cys)用于Fe3+的特异性响应，尤其是，Fe3+与其它金属离子共存时，荧光探针(CyQ‑Cys)的抗干扰能力；S4、Fe3+的检测测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ‑Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同浓度的Fe3+溶液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，检测不同浓度的Fe3+溶液荧光强度相应的变化情况；S5、黑茶备用液的制取：称取未处理的安化黑茶和发酵后的安化黑茶于沸水中浸泡10min，残渣在加沸水浸泡2次，滤液合并后浓缩，然后加入容量瓶中，用蒸馏水定容，获得黑茶备用液；S6、黑茶备用液测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ‑Cys)溶液和S5步骤中制取的黑茶备用液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化。...

【技术特征摘要】
1.一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备：将4-甲基-N-乙基喹啉、N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠溶于乙醇中，在氮气保护下于80℃反应1h，冷却后，旋蒸除溶剂，然后在氯仿和醋酸钠溶液中搅拌1h，过滤，真空干燥，柱层析分离，得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，以4-甲基喹啉与二醛缩合剂反应得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，便于后续的使用；S2、荧光探针(CyQ-Cys)溶液的制备：喹啉基花菁类衍生物(CyQ)用N，N-二甲基甲酰胺配成10mol/L溶液，半胱氨酸(Cys)用去离子水配成200mmol/L溶液，在离心管中依次加入10mol/L的喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液，逐滴加入200mmol/L的半胱氨酸(Cys)溶液，10mmol/L、pH值为7的磷酸缓冲盐溶液，混合均匀后用N，N-二甲基甲酰胺稀释，反应3min，随后，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，通过卤素-巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ-Cys)母液；S3、金属选择性实验：金属盐用去离子水配成1.0mmol/L溶液备用。在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同量的不同金属离子溶液，反应3min后，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号变化，检测荧光探针(CyQ-Cys)用于Fe3+的特异性响应，尤其是，Fe3+与其它金属离子共存时，荧光探针(CyQ-Cys)的抗干扰能力；S4、Fe3+的检测测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同浓度的Fe3+溶液，检测其荧光发射光谱，用荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长辉，王贞睿，齐风佩，曹一鸣，罗苗，肖刘平，
申请(专利权)人：湖南城市学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43