基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)制造技术

本发明专利技术公开了一种基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，属于环境分析技术领域。先制备量子点@铽离子‑单磷酸鸟嘌呤核苷酸(QDs@Tb‑GMP)复合物，酸性磷酸酶(ACP)催化GMP水解从而破坏QDs@Tb‑GMP的结构，导致Tb的绿色荧光淬灭，而QDs的红色荧光不变。As(V)可抑制ACP的活性，使得Tb的荧光不淬灭，随着As(V)浓度的增大，Tb与QDs的荧光比值(I547/I652)逐渐增加，构建了比率荧光法检测As(V)。此外，在紫外灯下，随着As(V)浓度的增加，QDs@Tb‑GMP溶液从红紫色变为橙色，可实现As(V)的可视化分析。QDs@Tb‑GMP的制备方法简便、水溶性好、环境友好，该比率荧光法不仅改善了测定As(V)的灵敏度，结合氧化处理还可用于检测实际样品中无机砷总量。

【技术实现步骤摘要】
基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)
本专利技术涉及一种基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，属于环境分析

技术介绍
无机砷污染是当前环境重金属污染问题中最为严重的问题之一。环境中五价砷(As(V))的存在十分广泛，尤以在含氧高的环境中为主。且水中的As(V)可轻易进入到鱼类、稻谷等水生动植物中，动植物体内As(V)的累积通过食物链而进入人体，从而造成砷对人类健康的危害。因而，世界卫生组织(WHO)对饮用水中砷的最高允许值规定为10ppb。As(V)和磷酸具有极高的相似性，如相同的化学结构，几乎相同的尺寸和pKa值，完全相同的含氧原子，热化学半径仅相差4％以及相似的金属亲和性等(EliasM,WellnerA,Goldin-AzulayK,ChabriereE,VorholtJA,ErbTJ,TawfikDS.Themolecularbasisofphosphatediscriminationinarsenate-richenvironments.Nature,2012,491,134-137)。磷酸是生命体组成必须的成分，而砷酸具有毒性，磷酸与砷酸的高度相似性为某些领域中砷酸盐有效取代磷酸盐提供了有力证据(Wolfe-SimonF,BlumJS,KulpTR,GordonGW,HoeftSE,Pett-RidgeJ,StolzJF,WebbSM,WeberPK,DaviesPCW,AnbarAD,OremlandRS.Abacteriumthatcangrowbyusingarsenicinsteadofphosphorus,Science,2011,332,1163-1166.)。由于砷取代磷酸形成的金属酯中间体稳定性较天然磷酸酯中间体更高，因此，As(V)被认为是磷酸酶的有效抑制剂。Cosnier等人基于酸性磷酸酶(ACP)和多酚氧化酶构建了双酶电化学传感器，利用As(V)对ACP的特异性抑制作用对水解后产物的分析实现了As(V)的灵敏电化学测定(CosnierS,MoustyC,CuiX,YangX,DongS.SpecificdeterminationofAs(V)byanacidphosphatase-polyphenoloxidasebiosensor.AnalyticalChemistry,2006,78,4985-4989)；利用As(V)对ACP的特异性抑制作用，电化学分析法(Sanllorente-MéndezS,Domínguez-RenedoO,Arcos-MartínezMJ.DevelopmentofacidphosphatasebasedamperometricbiosensorsfortheinhibitivedeterminationofAs(V).Talanta,2012,93,301-306)以及AuNPs比色分析法(ZhangJ,ZhangC-L,YuS-H.Tuninggoldnanoparticleaggregationthroughtheinhibitionofacidphosphatasebioactivity:Aplasmonicsensorforlight-upvisualdetectionofarsenate(AsV).ChemPlusChem,2016,81,1147-1151)也可用于定量检测As(V)。核酸/核苷酸与稀土离子组成的螯合聚合物纳米材料具有尖锐的发射峰、大的斯托克斯位移、长荧光寿命和高光化学稳定性等独特性质，在传感领域有广泛的应用。Nishiyabu等人发现核苷酸与镧系离子在水溶液中通过一步自适应性组装可得到无定型和超分子的网状结构(NishiyabuR,HashimotoN,ChoT,WatanabeK,YasunagaT,EndoA,KanekoK,NiidomeT,MurataM,AdachiC,KatayamaY,HashizumeM,KimizukaN.Nanoparticlesofadaptivesupramolecularnetworksself-assembledfromnucleotidesandlanthanideions.JournaloftheAmericanChemicalSociety,2009,131,2151-2158)。这种聚合物的制备方法简单，而且可以与其他无机纳米粒子进行组合形成纳米复合物，在传感分析中有很好的性能。比率荧光方法是克服单信号不稳定性的有效策略，而双发射的比率荧光探针可以通过内置的双荧光信号实现自我校准，以消除环境因素和生物样品产生的干扰，因而在荧光传感和成像中有着广泛的研究和应用(ChenT,HuY,CenY,ChuX,LuY.Adual-emissionfluorescentnanocomplexofgold-cluster-decoratedsilicaparticlesforlivecellimagingofhighlyreactiveoxygenspecies.JournaloftheAmericanChemicalSociety,2013,135,11595-11602)。更重要的是，基于比率荧光的传感体系有利于实现对靶物的可视化分析。探针上的两个分开的发射峰的荧光强度比值可以修正内在环境的干扰并排除激发光强度的波动，因而可提高定量分析的精确度。所以，发展简单而灵敏的基于稀土配位聚合物的比率荧光法检测As(V)在环境监测中具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术旨在提供了一种基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，它具有检测灵敏和可视化分析的优点。本专利技术通过如下技术方案实现：基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，包括以下步骤：(1)制备QDs@Tb-GMP纳米复合物：将10μL8μM的量子点(QDs)溶液、100μL10mM核苷酸(GMP)溶液与800μLHEPES缓冲溶液混合，再向溶液中加入100μL10mM的Tb3+溶液，并立刻剧烈震荡使溶液混合均匀，将得到黄色浑浊溶液在10000rpm转速下离心10min，收集黄色沉淀，用超纯水清洗沉淀三次，将得到的黄色沉淀产物分散在1mLHEPES缓冲溶液中，制成QDs@Tb-GMP溶液；(2)比率荧光法检测As(V)：将20μL800U/L的酸性磷酸酶溶液、不同浓度的As(V)溶液和50μLHEPES缓冲溶液混合，用超纯水稀释到总体积为100μL，在37℃水浴中反应90min，再加入150μL步骤(1)制备的QDs@Tb-GMP溶液，漩涡混匀后，在37℃水浴中反应40min，采用荧光分光光度计测量在激发波长为280nm时溶液的荧光光谱，根据不同浓度的As(V)与对应的Tb与QDs的荧光信号强度之间的比值的线性关系来实现对As(V)的高灵敏和选择性检测，进而还可结合氧化处理来用于检测实际样品中无机砷总量，或在紫外灯照射下，观察溶液颜色的变化来实现对As(V)的快速可视化分析。上述方法中，步骤(1)所述的HEPES缓冲溶液的浓度为25mM，pH为7.4；步骤(2)所述的HEPES缓冲溶液的浓度为50mM，pH为7.4，含25mM的Mg2+。本专利技术的原理是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，其特征在于，包括以下步骤：将20μL 800U/L的酸性磷酸酶溶液、不同浓度的As(V)溶液和50μL HEPES缓冲溶液混合，用超纯水稀释到总体积为100μL，在37℃水浴中反应90min，再加入150μL的QDs@Tb‑GMP溶液，漩涡混匀后，在37℃水浴中反应40min，采用荧光分光光度计测量溶液在激发波长为280nm时的荧光光谱，根据不同浓度的As(V)与对应的Tb与QDs的荧光信号强度之间的比值的线性关系来实现对As(V)的高灵敏和选择性检测，或还可结合氧化处理检测实际样品中无机砷总量，或在紫外灯照射下，观察溶液颜色的变化来实现对As(V)的快速可视化分析。

【技术特征摘要】
1.基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，其特征在于，包括以下步骤：将20μL800U/L的酸性磷酸酶溶液、不同浓度的As(V)溶液和50μLHEPES缓冲溶液混合，用超纯水稀释到总体积为100μL，在37℃水浴中反应90min，再加入150μL的QDs@Tb-GMP溶液，漩涡混匀后，在37℃水浴中反应40min，采用荧光分光光度计测量溶液在激发波长为280nm时的荧光光谱，根据不同浓度的As(V)与对应的Tb与QDs的荧光信号强度之间的比值的线性关系来实现对As(V)的高灵敏和选择性检测，或还可结合氧化处理检测实际样品中无机砷总量，或在紫外灯照射下，观察溶液颜色的变化来实现对As(V)的快速可视化分析。2.根据权利要求1所述基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱建丁，问少华，梁汝萍，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36