一种从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种从人外周血CTC中检测c‑MET基因拷贝数变异的方法，以及利用此方法从人外周血CTC中检测c‑MET基因拷贝数变异的试剂盒和该试剂盒在肿瘤患者不同阶段治疗检测中的应用。本发明专利技术的方法和试剂盒的使用有助于对患者进行指导性的个体化用药，检测结果可用于临床个体化治疗，预测治疗的有效性，便于临床用药选择，显著提高治疗效果，使患者最大程度受益；同时，还可以避免组织样本难以获得的问题，可以在患者治疗期进行监测。

【技术实现步骤摘要】
一种从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异的方法和试剂盒
本专利技术涉及肿瘤细胞检测领域，具体涉及一种从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异的方法和试剂盒。
技术介绍
随着生物分析技术的进步及信息化技术的发展，以及对基于基因医学理解的深入，精准医学(PrecisionMedicine)的概念从系统医学、转化医学、4P医学等概念中提炼出来，成为一种高度综合且细致的医学新模式，有望提高疾病预防和疾病治疗的水平。液态活检最早由Sorrells于1974年提出，是针对患者体内循环系统的一类非侵入性病理检测方法，能监测肿瘤或转移灶释放到血液的CTC、ctDNA碎片或者外泌体；该方法能够快捷、无创伤地对肿瘤患者进行诊断和治疗监测。当前液态活检技术已逐渐应用在肿瘤诊断治疗当中。ctDNA是肿瘤细胞释放入血液中的DNA片段，适用于早期筛查，个性化用药指导，耐药性监测等；CTC是实体肿瘤或转移病灶释入外周循环血的肿瘤细胞，适用于预后判断，疗效检测等。对于个体而言，无论是CTC、ctDNA还是外泌体，在病人个体层次存在较大的波动；尤其在早期检测中，CTC、ctDNA浓度比较低的情况下，ctDNA的检出率明显下降。CTC检测通过捕捉检测外周血中痕量存在的CTC，监测CTC类型和数量变化的趋势，以便实时监测肿瘤动态、评估治疗效果，实现实时个体治疗。随着CTC技术的成熟，通过测定CTC数目的变化，如果CTC数目是显著下降的，说明化疗药物是有效的，如果CTC数目还在增加说明药物是无效的，这时医生能够及时采取新的治疗方案。肿瘤的复发转移与CTC密切相关，监测CTC可早于常规影像学检查手段预估肿瘤复发风险。然而CTC在外周血中含量极低，目前CTC的富集和检测是其临床应用面临的最大挑战。因此，迫切需要一种能够对CTC进行定性的液态活检的检测技术和方法。c-MET原癌基因存在于人类7号染色体的长臂，蛋白产物是c-MET酪氨酸激酶受体，c-MET基因在胚胎期和成人期均有表达。c-MET的配体是肝细胞生长因子(HGF)，是由间质细胞分泌，HGF和c-MET的结合能够促进细胞的增殖、迁移、分化和形态改变。HGF/c-MET信号通路受到复杂的、高度的调节，在细胞增殖、分化和运动中发挥重要作用，而肿瘤组织中c-MET基因过表达是导致非小细胞肺癌的EGFR-TKI的耐药的主要原因。因此，研究一种从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异的方法具有迫切需求和重要意义，以期借助此方法对患者进行指导性的个体化用药，使此方法适合于肿瘤患者的不同阶段，包含但不限于早期、中期、晚期、手术前后、治疗检测及复发检测等。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异的方法。利用CTC高敏感性、高特异性、易检测的优点及高通量测序的通量高、灵敏度高、节约时间等优势；利用杂交捕获的方法针对富集后的CTC中的相关基因的热点突变区域进行目标高通量测序，从而对患者进行指导性的个体化用药，适合于肿瘤患者的不同阶段，包含但不限于早期、中期、晚期、手术前后、治疗检测及复发检测等。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异的方法，具体包括以下步骤：(a)采用差减法从人外周血中富集CTC；(b)获得c-MET基因拷贝数变异引物和特异性taqman探针；(c)获得内参基因特异性引物和特异性taqman探针；(d)建立c-MET基因拷贝数变异的检测方法，采用3D数字PCR平台，从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数；所述c-MET基因拷贝数变异检测的特异性taqman探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA荧光基团。c-MET基因对应的taqman探针，其碱基序列如SEQIDNO：1所示；从人外周血CTC中检测c-MET基因亚型的特异性上下游引物，其碱基序列如SEQIDNO：2(上游引物)和SEQIDNO：3(下游引物)所示；内参基因对应的taqman探针，其碱基序列如SEQIDNO：4所示；内参基因亚型的特异性上下游引物，其碱基序列如SEQIDNO：5(上游引物)和SEQIDNO：6(下游引物)所示。本专利技术还提供了一种利用上述方法从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异的试剂盒以及该试剂盒在肿瘤患者检测中的应用。所述试剂盒包括：c-MET基因拷贝数变异检测的特异性taqman探针，其碱基序列如SEQIDNO：1所示；c-MET基因拷贝数变异引物，其碱基序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示；内参基因对应的特异性taqman探针，其碱基序列如SEQIDNO：4所示；内参基因引物，其碱基序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术方法可用于在人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异，利用CTC高敏感性、高特异性、易检测的优点及高通量测序的通量高、灵敏度高、节约时间等优势；利用杂交捕获的方法针对富集后的CTC中的相关基因的热点突变区域进行目标高通量测序；检测结果可用于临床个体化治疗，预测治疗的有效性，便于临床用药选择，显著提高治疗效果，使患者最大程度受益；同时，还可以避免组织样本难以获得的问题，可以在患者治疗期进行监测。(2)本专利技术的试剂盒设计简单、操作简便、快速、高通量；适用于肿瘤患者的不同阶段，包含但不限于早期、中期、晚期、手术前后、治疗检测及复发检测中的应用。附图说明图1为本专利技术从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异的检测流程。图2为荧光定量PCR检测体系对10倍系列稀释c-MET基因标准品的定量曲线。图3为荧光定量PCR检测体系对10倍系列稀释内参基因标准品的定量曲线。图4为CTC细胞的c-MET基因拷贝数变异检测结果。具体实施方式下面通过附图和具体实施例对本专利技术技术方案进行详细说明，但是本专利技术的保护范围不局限于所述实施例。实施例1：采用差减法从人外周血中富集CTC仪器：天平、离心机、移液器、振荡混合仪。试剂：10×CRC清洗液(泰州赛特生物)、Cytelligen细胞分离液(泰州赛特生物)、免疫磁珠结合缓冲液(来自IP试剂盒，上海长哲生物)。步骤：(1)采集病人外周血：为避免上皮细胞污染，弃掉前2mL血液后，使用提供的采血管采集6.0mL血液，并立即头尾颠倒混匀采血管5-10次。(2)将采血管用天平配平，头尾颠倒混匀后室温离心，2000rpm20min。弃上清至棕红色沉淀上方5mm处，加入10×CRC清洗液至采血管标签黄线满管处，盖上黄色管帽，头尾颠倒混匀10次。(3)于离心管A中加入3mLCytelligen细胞分离液，将采血管轻柔头尾颠倒混匀，使用手动移液器将采血管中的血细胞沿离心管A管壁液面处缓慢加到分离液顶层，切忌将血细胞加入到分离介质中。叠加后可见清晰的分界面，少量红细胞慢慢沉淀至管底。配平后室温离心，450rpm7min。(4)离心后可见三层液体，上层为黄色液体(Layer1)，中间层为透明液体(Layer2)，底层为棕红色沉淀红细胞(Layer3)。但个别患者因治疗等原因导致部分红细胞处于中间层，未离心至管底，仍按下述方法吸取上清。将离心管A中底层红细胞上的所有液体转移至50mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从人外周血CTC中检测c‑MET基因拷贝数变异的方法，其特征在于，包括：(a)采用差减法从人外周血中富集CTC；(b)获得c‑MET基因拷贝数变异引物和特异性taqman探针；(c)获得内参基因特异性引物和特异性taqman探针；(d)建立c‑MET基因拷贝数变异的检测方法，采用3D数字PCR平台，从人外周血CTC中检测c‑MET基因拷贝数；所述c‑MET基因拷贝数变异检测的特异性taqman探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA荧光基团。

【技术特征摘要】
1.一种从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数变异的方法，其特征在于，包括：(a)采用差减法从人外周血中富集CTC；(b)获得c-MET基因拷贝数变异引物和特异性taqman探针；(c)获得内参基因特异性引物和特异性taqman探针；(d)建立c-MET基因拷贝数变异的检测方法，采用3D数字PCR平台，从人外周血CTC中检测c-MET基因拷贝数；所述c-MET基因拷贝数变异检测的特异性taqman探针的5’端标记FAM荧光基团，3...

【专利技术属性】
技术研发人员：高雯，徐静，王学浩，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32