植物幼嫩叶片色素测定方法技术

本发明专利技术给出一种植物幼嫩叶片色素的测定方法，其包括供试样品制备和比色法检测。供试样品制备步骤包括：称取适量植物幼嫩叶片到装有钢珠的离心管中，倒入液氮使植物叶片快速凝结，于涡旋仪上迅速粉碎，用锡箔纸裹住离心管，按一定质量体积比加入溶剂，在一定温度和光照条件下浸提一定时间后离心，上清液即为供试样品。比色法检测步骤包括：对紫外分光光度计使用提取溶剂作为空白进行基线校正，测定663nm、646nm和470nm下的吸光度值，利用Wellburn公式(1984)计算叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量。本发明专利技术操作简便，效率高，时间短，测定结果准确、稳定，可用于科研和工业生产中对植物幼嫩叶片色素的快速提取和精确测定，具有较高的推广和应用价值。

Method for determination of pigments in young leaves of plants

The invention provides a method for determining pigments in young plant leaves, which includes sample preparation and colorimetric detection. Sample preparation steps include: weighing appropriate amount of tender plant leaves into a centrifugal tube with steel balls, pouring liquid nitrogen to make the plant leaves condense rapidly, crushing rapidly on a scroll meter, wrapping the centrifugal tube with tin foil, adding solvent according to a certain mass-volume ratio, soaking at a certain temperature and light conditions for a certain time, and centrifuging. The supernatant is the sample. The detection steps of colorimetric method include: baseline calibration of ultraviolet spectrophotometer using extractive solvent as blank, determination of absorbance at 663, 646 and 470 nm, and calculation of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid content by Wellburn formula (1984). The method has the advantages of simple operation, high efficiency, short time, accurate and stable determination results, and can be used for rapid extraction and accurate determination of pigments from young leaves of plants in scientific research and industrial production, and has high popularization and application value.

【技术实现步骤摘要】
植物幼嫩叶片色素测定方法
本专利技术属于植物生理
，涉及一种高效快速测定植物幼嫩叶片色素的方法，特别涉及使用紫外分光光度计测定植物叶片色素的方法，适合于测定植物幼嫩叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。
技术介绍
高等植物叶片色素的构成主要包含叶绿素和类胡萝卜素，叶绿素主要包含叶绿素a和叶绿素b，类胡萝卜素主要分为胡萝卜素和叶黄素两大类。叶绿素是植物进行光合作用的重要成分，也是反映植物生理状况的重要指标。类胡萝卜素不仅作为光合作用中的辅助色素参与光能的吸收和传递，还具有抗氧化、抗癌以及抗辐射的作用。因此，叶绿素和类胡萝卜素的提取和测定在生产和科研工作中非常重要。提取植物组织中色素的主要有机溶剂包括氯仿、石油醚、丙酮、乙醇和二甲基亚砜等，通常使用丙酮和乙醇按一定比例进行混合或其水溶液提取植物色素。目前，以丙酮提取法使用最为广泛，最早于1941年由Mackinney提出(MackinneyG.Absorptionoflightbychlorophyllsolutions[J].JournalofBiologicalChemistry,1941,140(2):315-322.)，1949年经Arnon解释和推导(ArnonDI.Copperenzymesinisolatedchloroplasts.PolyphenoloxidaseinBetavulgaris[J].PlantPhysiology,1949,24(1):1-15.)，该法的产生革新了最早的叶绿素皂化测定法，操作相对简单，耗时大幅缩短。丙酮提取法主要是使用80％丙酮进行研磨提取，然后经过洗转、过滤和定容等步骤，过程较为复杂，且色素测定值偏低。苏展等人将此法进行改进并提出了叶绿素简化提取法，即将植物绿色组织剪碎后直接使用80％丙酮浸提(苏展,张晓素,陈娟,等.叶绿素含量测定的简化[J].植物生理学通讯,2010,46(4):399-402.)。这一方法大大简化了操作过程，节省了植物材料和试剂的用量，但提取时间过长，一般需要24-72小时才能提取完全。邱念伟等人专利技术了DMSO-80％丙酮两步快速提取法，先用DMSO高温提取叶绿素，再用80％丙酮稀释浸提，可以有效减小测定误差，加快测定速度，将提取时间缩短到3个小时(邱念伟,王修顺,杨发斌,等.叶绿素的快速提取与精密测定[J].植物学报,2016,51(5):667-678.)。吴志旭等人改用热丙酮浸提叶绿素，使浸提时间缩短为1.5-2.5小时(吴志旭,张雅燕.浮游植物体内叶绿素a测定方法的改进[J].化学分析计量,2002,11(6):37-38.)。即便如此，以上方法仍较为繁琐，提取时间较长或存在安全隐患，客观上难以做到避光操作，因而色素提取效率不高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题：现有叶绿素和类胡萝卜素提取过程复杂、耗时长以及效率低等问题。为解决上述技术问题，本专利申请专利技术人根据文献调研结果获知，国内外尚无利用液氮辅助测定植物叶片色素的报道。为了简化色素的提取步骤，缩短色素的提取时间以及提高色素的提取效率等问题，本专利技术提供一种植物幼嫩叶片色素测定方法。本专利技术通过探索最佳的色素提取方式，筛选最佳提取时间、温度以及质量体积比，以实现植物幼嫩叶片色素的快速提取和精确测定。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现：植物幼嫩叶片色素测定方法，包括供试样品制备步骤和比色法检测步骤，其所述供试样品制备步骤包括：使用液氮冷却植物叶片，粉碎后用溶剂提取叶片中的色素，提取液离心，取上清液，制得供试样品。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，其所述供试样品制备步骤具体包括：将植物叶片置入装有钢珠的离心管中，倒入液氮使植物叶片凝结，于涡旋仪上粉碎，加入溶剂，在一定温度和光照条件下浸提一定时间后离心，上清液即为供试样品。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，所述溶剂选用丙酮，或乙醇，或丙酮和乙醇的混合溶液，或丙酮、乙醇和水的混合溶液。进一步优选地，所述溶剂选用丙酮和乙醇的混合溶液，以体积比计，丙酮:乙醇＝1:1，或丙酮:乙醇＝2:1，或丙酮:乙醇＝1:2；所述溶剂选用丙酮、乙醇和水的混合溶液，以体积比计，丙酮:乙醇:水＝6:3:1，或丙酮:乙醇:水＝3:6:1，或丙酮:乙醇:水＝4.5:4.5:1。经本专利技术实施例的结果验证，植物叶片色素的最佳提取溶剂为95％乙醇(体积比)。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，所述浸提温度为-20～37℃。进一步优选地，植物叶片色素的最佳提取温度为4℃。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，所述浸提光照强度为0～1000lux。进一步优选地，植物叶片色素的最佳提取光照条件为0lux(黑暗条件)。具体的实施方式是所述离心管用锡箔纸裹住，在黑暗条件下进行浸提。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，所述浸提时间为1～60min。进一步优选地，植物叶片色素的最佳提取时间为5min。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，以g/mL计，待测植物叶片与提取溶剂的质量体积比范围为1/400～1/25。进一步优选地，植物叶片色素的最佳提取质量体积比为1/100(叶片与溶剂，g/mL)。对于本专利技术所述的植物幼嫩叶片色素测定方法，其所述比色法检测步骤包括：测定供试样品在663nm、646nm和470nm处的吸光度值，利用Wellburn改良法计算叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的含量。本专利技术所述的植物幼嫩叶片色素测定方法，尤其适用于植物幼嫩叶片色素的高效快速测定。基于上述参数的优化，本专利技术给出一种优化的植物幼嫩叶片色素测定方法，其包括供试样品制备步骤和比色法检测步骤：(1)供试样品制备称取适量植物幼嫩叶片到装有钢珠的离心管中，倒入液氮使植物叶片快速凝结，于涡旋仪上迅速粉碎，用锡箔纸裹住离心管，加入最佳溶剂，在适宜的温度、光照条件以及合适的质量体积下提取一定时间，提取液离心，上清液即为供试样品。(2)比色法检测将步骤(1)制得的供试样品使用比色法进行检测，测定其在663nm、646nm和470nm处的吸光度值，使用Wellburn改良法(WellburnAR,LichtenthalerHK.Formulaeandprogramtodeterminetotalcarotenoidsandchlorophyllsaandbofleafextractsindifferentsolvents[M].1984:SpringerNetherlands.9-12.)计算色素含量。Wellburn改良法计算色素含量的公式如下：Ca(mg/gFW)＝(12.21A663–2.81A646)×V/(1000×W)；Cb(mg/gFW)＝(20.13A646–5.03A663)×V/(1000×W)；C总(mg/gFW)＝(17.32A646+7.18A663)×V/(1000×W)；Cx·c(mg/gFW)＝[(1000A470–3.27Ca–104Cb)/229]×V/(1000×W)。式中：Ca——叶绿素a含量；Cb——叶绿素b含量；C总——叶绿素总含量；Cx·c——类胡萝卜素含量；A663——样品在663nm处的吸光度值；A646——样品在646nm处的吸光度值；A470——样品在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物幼嫩叶片色素测定方法，包括供试样品制备步骤和比色法检测步骤，其特征在于，所述供试样品制备步骤包括：使用液氮冷却植物叶片，粉碎后用溶剂提取叶片中的色素，提取液离心，取上清液，制得供试样品。

【技术特征摘要】
1.植物幼嫩叶片色素测定方法，包括供试样品制备步骤和比色法检测步骤，其特征在于，所述供试样品制备步骤包括：使用液氮冷却植物叶片，粉碎后用溶剂提取叶片中的色素，提取液离心，取上清液，制得供试样品。2.根据权利要求1所述的植物幼嫩叶片色素测定方法，其特征在于，所述供试样品制备步骤具体包括：将植物叶片置入装有钢珠的离心管中，倒入液氮使植物叶片凝结，于涡旋仪上粉碎，加入溶剂，在一定温度和光照条件下浸提一定时间后离心，上清液即为供试样品。3.根据权利要求1或2所述的植物幼嫩叶片色素测定方法，其特征在于，所述溶剂选用丙酮，或乙醇，或丙酮和乙醇的混合溶液，或丙酮、乙醇和水的混合溶液。4.根据权利要求2所述的植物幼嫩叶片色素测定方法，其特征在于，所述浸提温度为-20～37℃。5.根据权利要求2所述的植物幼嫩叶片色素测...

【专利技术属性】
技术研发人员：周武先，张美德，段媛媛，卢超，艾伦强，何银生，刘海华，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院中药材研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42