一种细胞周期检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞周期检测试剂盒，试剂盒包括试剂一和试剂二；试剂一包括DMEM培养基，0.05％‑0.5％胰蛋白酶和清洗缓冲液；试剂二包括2‑5ml的Cystain DNA l step、100‑120ul低渗裂解缓冲液、0.5‑5ul的磷酸组化蛋白H3一抗和0.2‑2.0ul的磷酸组化蛋白H3二抗。本发明专利技术中的试剂盒运用流式细胞技术，能够快速精准地测定细胞周期，并将G2期和M期进行区分。

A Kit for Cell Cycle Detection

The invention discloses a cell cycle detection kit, which comprises reagent 1 and reagent 2; reagent 1 includes DMEM culture medium, 0.05%-0.5% trypsin and cleaning buffer; reagent 2 includes 2 5ml Casein DNA L step, 100 120ul hypoosmotic lysis buffer, 0.5 5ul phosphohistone H3 1 antibody and 0. 2.0 UL phosphohistochemical protein H3 antibody. The kit in the invention uses flow cytometry technology to quickly and accurately determine cell cycle and distinguish G2 and M phases.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞周期检测试剂盒
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种细胞周期检测试剂盒。
技术介绍
细胞周期是指连续分裂的细胞，从一次完成分裂开始，到下一次完成分裂时为止的过程。细胞周期是细胞生命活动的基本过程，测定所培养细胞的细胞周期有利于对细胞的生长及细胞的DNA合成代谢进行研究。一个细胞周期可以人为地划分为先后连续的4个时期，即G1期、S期、G2期和M期，细胞周期中的各个时期也常称为时相，DNA含量随时相变化而发生周期性变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各时期的分布状态，计算出G1％、S％和G2/M％，了解细胞的增殖能力。磷酸化能够破坏组蛋白与DNA间的相互作用，而使染色质不稳定。组蛋白H3的磷酸化作用发生在早前期细胞染色体的着丝粒处，成点状分布，继而在早中期达到最高水平，并在中期以点状集中在赤道板上，在后期开始脱磷酸化，并于末期完成脱磷酸化。目前，流式细胞仪检测细胞周期的常用染料是碘化丙啶(propidiumiodide，PI)，它可以嵌入到核酸的双螺旋碱基对中与之结合，但没有碱基特异性，因此染色前必须用核糖核酸酶A(RNase)处理，以排除双链RNA的干扰。此外，PI是大分子染料，不能透过完整的细胞膜，不能标记活细胞，染色前样品需进行固定和透膜处理，样品处理环节多，耗时长。4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)，也是标记细胞DNA的染料，可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。DAPI与双链DNA结合时，荧光强度增强200倍，而与单链DNA结合时无荧光增强，与RNA结合不会形成强荧光，明显弱于DNA染色前无需用RNase处理细胞。此外，DAPI有膜渗透性，能标记活细胞，可见，DAPI是理想的DNA定量染料。进行标记，对G2期和M期进行区分，是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种细胞周期检测试剂盒，运用流式细胞技术，能够快速精准地测定细胞周期，并将G2期和M期进行区分。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种细胞周期检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括DMEM培养基，0.05％-0.5％胰蛋白酶和清洗缓冲液；试剂二包括2-5ml的CystainDNA1step、100-120ul低渗裂解缓冲液、0.5-5ul的磷酸组化蛋白H3一抗和0.2-2.0ul的磷酸组化蛋白H3二抗。本专利技术利用DAPI标记DNA，可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合，DAPI与双链DNA结合时，荧光强度增强200倍，其与单链DNA结合时无荧光增强，与RNA结合不会形成强荧光，故本专利技术无需用RNase对细胞进行处理。本专利技术建立低渗缓冲液破膜方法，在细胞中的DNA进行染色时，同时对磷酸化组蛋白H3进行标记，运用流式细胞技术，快速精准地测定细胞周期，并将G2期和M期进行区分。进一步地，所述清洗缓冲液为Dulbecco’s磷酸盐缓冲液、D-PBSB缓冲液或D-PBS缓冲液。本专利技术中的CystainDNA1step的主要成分为DAPI，而DAPI为具有细胞膜通透性的DNA染料；同时DAPI污染小，更容易清洗。进一步地，所述低渗裂解缓冲液包括去离子水、重量体积比为0.1％的柠檬酸钠、体积比为0.1-0.5％的NP-40和1.5-2mM的EDTA。本专利技术公开的低渗裂解缓冲液，其中的裂解成分经过精心优化，能快速使细胞裂解。进一步地，所述DMEM培养基为含有10％BSA的DMEM培养基。进一步地，试剂二包括3ml的CystainDNA1step、105ul低渗裂解缓冲液、3ul的磷酸组化蛋白H3一抗和1.0ul的磷酸组化蛋白H3二抗。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术提供了一种细胞周期检测试剂盒，具有如下技术优点：(1)本专利技术公开的试剂盒流程简单，不需要固定过夜及RNase对细胞进行处理，且DAPI污染小，容易清洗；(2)DAPI对细胞染色后，4℃放置24小时后，与染色后立即检测结果一致，故本专利技术公开的试剂盒具有良好的稳定性，且方便上机时间的安排；(3)本专利技术公开的试剂盒，能够快速精准地测定细胞周期，并将G2期和M期进行区分。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1小鼠成纤维细胞购自于苏州北纳创联生物技术有限公司编号BNCC100032。DMEM培养基(Gibco)、小牛血清即BSA(Gibco)、胰蛋白酶(Gibco)/TritonX-100(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)、CystainDNA1step(Partec)，Alexa647ratanti-phospho-HistoneH3(pS28)(BD，BDBioscience，catalognumber：558217)、Donkeyanti-RatIgG(H+L)HighlyCross-AdsorbedSecondaryAntibody，AlexaFluor48(Thermo)其中流式细胞仪具有紫外激光光源。将液氮冻存的小鼠成纤维细胞，用38℃水浴复苏，接种在培养瓶中，培养基为含有10％小牛血清的DMEM培养基，置37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞融合率达到80％时，用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用含10％血清的DMEM培养基终止消化，离心收集细胞，用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液清洗3次，每次15min，后离心收集细胞。其中，配制低渗裂解缓冲液，其中低渗裂解缓冲液包括去离子水、重量体积比为0.1％的柠檬酸钠、体积比为0.1％的NP-40和2mM的EDTA。在离心收集的细胞中加入105ul低渗裂解缓冲液和3ul的磷酸化组蛋白H3一抗，在室温下避光孵育2小时，后利用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液清洗3次，每次15min。最后加入1ul二抗，在室温下避光孵育30min，后利用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液清洗3次，每次15min，收集细胞，并除去碎片和粘连体。将收集的细胞加入3mLCystainDNA1step，室温染色30S后，取1mL用流式细胞仪检测细胞周期，标记为1-1，剩下的样品放置在4℃冰箱，24h后再次用流式细胞仪检测细胞周期，标记为1-2。实施例2将液氮冻存的小鼠成纤维细胞，用38℃水浴复苏，接种在培养瓶中，培养基为含有10％小牛血清的DMEM培养基，置37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞融合率达到80％时，用0.05％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用含10％血清的DMEM培养基终止消化，离心收集细胞，用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液清洗3次，每次15min，后离心收集细胞。其中，配制低渗裂解缓冲液，低渗裂解缓冲液包括去离子水、重量体积比为0.1％的柠檬酸钠、体积比为0.5％的NP-40和1.5mM的EDTA。在离心收集的细胞中加入100ul低渗裂解缓冲液和5.0ul的磷酸化组蛋白H3一抗，在室温下避光孵育2小时，后利用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液清洗3次，每次15min。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞周期检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括DMEM培养基，0.05％‑0.5％胰蛋白酶和清洗缓冲液；试剂二包括2‑5ml的Cystain DNA 1step、100‑120ul低渗裂解缓冲液、0.5‑5ul的磷酸组化蛋白H3一抗和0.2‑2.0ul的磷酸组化蛋白H3二抗。

【技术特征摘要】
1.一种细胞周期检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括DMEM培养基，0.05％-0.5％胰蛋白酶和清洗缓冲液；试剂二包括2-5ml的CystainDNA1step、100-120ul低渗裂解缓冲液、0.5-5ul的磷酸组化蛋白H3一抗和0.2-2.0ul的磷酸组化蛋白H3二抗。2.根据权利要求1所述的一种细胞周期检测试剂盒，其特征在于，所述清洗缓冲液为Dulbecco’s磷酸盐缓冲液、D-PBSB缓冲液或D-PBS缓冲液。3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李德冠，董银萍，吴静，王梅芳，
申请(专利权)人：中国医学科学院放射医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12