单核细胞增生李斯特氏菌标准样品及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种单核细胞增生李斯特氏菌标准样品及其制备方法，属于微生物学检测方面的质量控制领域。标准样品包括目标菌和背景菌群，所述目标菌为单核细胞增生李斯特氏菌，所述背景菌群由英诺克李斯特氏菌，绵羊李斯特氏菌，金黄色葡萄球菌组成。本发明专利技术均匀性、稳定性符合标准样品要求，可以最大程度保证测试样品的稳定性，从满足特殊运输的条件着手，通过特殊工艺的研究、稳定性和均匀性的研究等形成一套完善的标准样品制备技术，适合于制备符合标准样品要求的猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，适用于实验室的能力验证、质量控制、方法验证等用途。

Standard sample of Listeria monocytogenes and its preparation method

The invention discloses a standard sample of Listeria monocytogenes and a preparation method thereof, which belongs to the field of quality control in microbiological detection. Standard samples include target bacteria and background bacteria, the target bacteria are Listeria monocytogenes, and the background bacteria are composed of Listeria Inococcus, Listeria sheep and Staphylococcus aureus. The uniformity and stability of the present invention meet the requirements of standard samples, and can guarantee the stability of test samples to the greatest extent. Starting from meeting the conditions of special transportation, a set of perfect standard sample preparation technology is formed through the study of special technology, stability and uniformity, which is suitable for preparing standard samples meeting the requirements of standard samples. The standard sample of Listeria monocytogenes in pork is suitable for laboratory capacity verification, quality control and method verification.

【技术实现步骤摘要】
单核细胞增生李斯特氏菌标准样品及其制备方法
本专利技术提供一种猪肉作为主要基质的单核细胞增生李斯特氏菌标准样品及其制备方法，属于微生物学检测方面的质量控制领域。
技术介绍
猪饲养简易，猪肉又具有骨细筋少肉多的特点，是世界范围内主要的肉类食品。猪肉富含蛋白质及脂肪、碳水化合物、钙、铁、磷等营养成分，经过烹调加工后肉味特别鲜美，是我国餐桌上重要的动物性食品之一。我国猪肉的主要消费形式是经过加工的冷鲜肉，由于猪肉营养物质和水分含量都比较高，所以很容易受到微生物的污染。在屠宰过程中，猪肉不可避免要携带来自环境和动物肠道、皮毛等部位的大量微生物，所以生产加工和储藏过程中，如果处理不当很容易造成微生物的二次污染。受微生物污染的猪肉，如果携带致病菌，或者迅速繁殖，可能会对公众健康构成潜在的威胁，因此，提高产品质量、加强猪肉微生物的检测和控制对保障食品安全至关重要。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)简称单增李斯特菌，是一种人畜共患病的食源性致病菌，人类感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，并且在4℃的条件下仍可生长繁殖，是威胁人类健康的主要病原菌之一，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。因此，制备单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，尤其是有合适食品基质的标准样品对实验室能力验证、质量控制、方法验证等都有深远的意义。在单核细胞增生李斯特氏菌标准样品中，如果目标菌易发生变化(繁殖或死亡等)，会导致标准样品均匀性和稳定性较差，影响标准样品的使用效果和保质期。因此，在制备猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品时，需要综合考虑选用标准菌株的生化特性，冻干的工艺条件，冻干前对目标菌的低温刺激和基质中保护剂的添加等交互的关系，以达到最佳的冻干效果。单核细胞增生李斯特氏菌最常见的污染食品为肉及肉制品，猪肉是我国最主要肉食消费品，所以猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌的检测直接关系猪肉的卫生质量和致病风险。制备均匀性和稳定性良好的以猪肉为基质的单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，可以避免单核细胞增生李斯特氏菌检验的随意性和不确定性，对实验室进行能力验证、方法验证、仪器校准、测试结果的质量控制等都具有特殊重要的意义。
技术实现思路
本专利技术是将猪肉作为一种基质，向其中加入一定量的单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株，经过一系列冷冻干燥的工艺处理，同时加入针对单核细胞增生李斯特氏菌的保藏干燥保护剂，制成猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，目的是克服单核细胞增生李斯特氏菌标准样品中目标菌的活菌数在运输、储藏和检测等过程中容易发生变化的问题，提供一种均匀性、稳定性符合标准样品要求的猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，并确保该制备方法的工艺简单可行，成功率高。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案是：本专利技术提供了一种单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，包括目标菌和背景菌群，所述目标菌为单核细胞增生李斯特氏菌，所述背景菌群由英诺克李斯特氏菌，绵羊李斯特氏菌，金黄色葡萄球菌组成。本专利技术的标准样品以猪肉、丙酮酸钠、维生素C和无菌生理盐水为基质，其中丙酮酸钠的浓度为500mg/kg、维生素C的浓度为500mg/kg。在本领域中，标准样品经常发生目标菌繁殖或死亡的现象，大大影响标准样品的均匀性和稳定性。为克服该现象，本专利技术在基质中加入特制的干燥保护剂，浓度为500mg/kg。所述的干燥保护剂成分为：脱脂乳粉，谷氨酸钠、羧甲基纤维素钠，瓜尔胶、海藻酸钠。重量比为：5:1-2:1-3:2-5:1-3。现有公开的文献中，关于微生物干燥保护剂的成分比较多，常见的成分都是脱脂乳粉、海藻糖、谷氨酸钠等，本专利技术针对单核细胞增生李斯特氏菌在真空冷冻条件下容易死亡、不易保存的特点，提供一种特定的保护剂，利用羧甲基纤维素钠吸湿性的特点，防治在冷冻干燥下，微生物大量失水造成目标菌的死亡，羧甲基纤维素钠可以让水分缓慢蒸发，提高目标菌的成活率。瓜尔胶为大分子天然亲水胶体，属于天然半乳甘露聚糖，品质改良剂之一，一种天然的增稠剂。瓜尔胶可以保护微生物在保藏过程中对极端低温条件下的反应，让微生物更好的处于休眠状态。所述样品中目标菌的目标浓度为102～103CFU/g，背景菌群的目标浓度为103～104CFU/g。本专利技术还提供一种制备所述的菌标准样品的方法，包括样品基质的选择及制备、添加菌株的选择、菌株复苏传代、增菌、对目标菌的低温刺激、菌悬液配制、样品分装、真空冷冻干燥和包装、储存等，具体过程为：(1)样品基质的选择及制备选购猪的脊椎骨内侧的条状嫩肉，即猪的里脊肉，要求其色泽红润，肉质透明，质地紧密，富有弹性，手按后能够很快复原，并除去连在肉上的筋和膜，只保留质嫩无筋的瘦肉。将猪肉混合搅匀，每5kg搅碎猪肉中加1kg丙酮酸钠和1kg维生素C溶液，丙酮酸钠的浓度为500mg/kg、维生素C的浓度为500mg/kg，混匀制成肉浆。(2)添加菌株的选择根据选择单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogens)ATCC13932，英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090，绵羊李斯特氏菌(Listeriaivanuii)ATCCBAA-139，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC29213。(3)菌株复苏传代将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基上，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定。(4)增菌将鉴定后符合要求的标准菌株接种到营养肉汤中，在36±1℃下进行培养，目标菌培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，备用。(5)低温刺激将对数生长期的目标菌放到4±1℃下继续培养，培养至稳定期，备用。(6)菌悬液的配制将上述过程(4)和(5)得到的菌液，用无菌生理盐水进行梯度稀释，稀释到目标菌的目标浓度为105～106CFU/mL，背景菌群的目标浓度为106～107CFU/mL，将目标菌和背景菌群的稀释液1:1混合均匀，得到备用混合菌液。(7)样品分装向步骤(1)得到的猪肉肉浆中加入步骤(6)得到的混合菌液7mL，加入干燥保护剂，进一步混合，使用搅拌器不断搅拌，确保菌液和肉糜混合均匀，将混合均匀的肉糜分装到样品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实，每瓶重量为1.5g。(8)真空冷冻干燥和包装将装有肉糜的样品瓶开盖放入冻干机中，真空冷冻干燥48～50h，当样品冻干程序结束后，直接在冻干机内进行压塞，关闭机器，进行放气，取出样品时样品瓶内为真空状态；(9)储存取出的样品再加盖金属盖进行密封，放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品进行均匀性和稳定性实验。所述样品的均匀性和稳定性试验依据CNAS-GL03:2006《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》进行。本专利技术均匀性、稳定性符合标准样品要求，可以最大程度保证测试样品的稳定性，从满足特殊运输的条件着手，通过特殊工艺的研究、稳定性和均匀性的研究等形成一套完善的标准样品制备技术，适合于制备符合标准样品要求的猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，适用于实验室的能力验证、质量控制、方法验证等用途。本专利技术也解决了国内肉类食品中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品紧缺的状况，不同基质的致病菌标准样品具有广阔的市场，有较大的经济本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，其特征是：包括目标菌和背景菌群，所述目标菌为单核细胞增生李斯特氏菌，所述背景菌群由英诺克李斯特氏菌，绵羊李斯特氏菌，金黄色葡萄球菌组成。

【技术特征摘要】
1.单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，其特征是：包括目标菌和背景菌群，所述目标菌为单核细胞增生李斯特氏菌，所述背景菌群由英诺克李斯特氏菌，绵羊李斯特氏菌，金黄色葡萄球菌组成。2.根据权利要求1所述的标准样品，其特征是：所述样品以猪肉、丙酮酸钠、维生素C和无菌生理盐水为基质，其中丙酮酸钠的浓度为500mg/kg、维生素C的浓度为500mg/kg。3.根据权利要求2所述的标准样品，其特征是，基质中还加入干燥保护剂，浓度为500mg/kg；所述的干燥保护剂成分为：脱脂乳粉，谷氨酸钠、羧甲基纤维素钠，瓜尔胶、海藻酸钠。4.根据权利要求1所述的标准样品，其特征是：脱脂乳粉，谷氨酸钠、羧甲基纤维素钠，瓜尔胶、海藻酸钠的重量比为：5:1-2:1-3:2-5:1-3。5.根据权利要求1所述的标准样品，其特征是：所述样品中目标菌的目标浓度为102~103CFU/g，背景菌群的目标浓度为103~104CFU/g。6.制备权利要求1所述的菌标准样品的方法，其特征是：包括样品基质的选择及制备、添加菌株的选择、菌株复苏传代、增菌、对目标菌的低温刺激、菌悬液配制、样品分装、真空冷冻干燥和包装、储存等，具体过程为：（1）样品基质的选择及制备选购猪的脊椎骨内侧的条状嫩肉，即猪的里脊肉，要求其色泽红润，肉质透明，质地紧密，富有弹性，手按后能够很快复原，并除去连在肉上的筋和膜，只保留质嫩无筋的瘦肉；将猪肉混合搅匀，每5kg搅碎猪肉中加1kg丙酮酸钠和1kg维生素C溶液，丙酮酸钠的浓度为500mg/kg、维生素C的浓度为500mg/kg，混匀制成肉浆；（2）添加菌株的选择根据权利要求1选择单核细胞增生李斯...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐静，贾俊涛，黄小华，吴振兴，方佩佩，林超，张晓良，赵丽青，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37