一种无菌微拟球藻的制备方法技术

本发明专利技术公开一种无菌微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)的制备方法，以抗生素的抑菌/杀菌作用为基础，通过筛选具有高效抑菌/杀菌活性，且对藻类毒性小，同时具备不同抑菌/杀菌机制的抗生素，以不同种类抗生素协同作用的方式，达到去除微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)中细菌的目的；所述抗生素及其浓度分别为25～100μg/mL的氯霉素、25～150μg/mL的四环素和25～400μg/mL的头孢曲松钠。本方法工艺简单，便于操作，可推广性强，采用本发明专利技术制备的无菌藻株仍保持良好的活性，可正常生长。

A Method for the Preparation of Aseptic Micrococcoid Algae

The invention discloses a preparation method of aseptic micrococcidia (Nannochloropsis gaditana), which is based on the bacteriostasis/bactericidal effect of antibiotics and has high bacteriostasis/bactericidal activity by screening antibiotics with low toxicity to algae and different bacteriostasis/bactericidal mechanisms, and synergistic effect of different kinds of antibiotics. In order to remove bacteria from Nannochloropsis gaditana, the antibiotics and their concentrations are 25-100 ug/mL of chloramphenicol, 25-150 ug/mL of tetracycline and 25-400 ug/mL of ceftriaxone sodium, respectively. The method has the advantages of simple process, easy operation and strong popularization. The aseptic algae strains prepared by the method still maintain good activity and can grow normally.

【技术实现步骤摘要】
一种无菌微拟球藻的制备方法
本专利技术属于微藻的无菌化制备
，具体涉及采用抗生素处理的方法去除微拟球藻藻液中细菌制备无菌微拟球藻的方法。
技术介绍
微藻是一种重要的生物资源，具有分布广、营养丰富、种类繁多、适应能力强、可定向培养等特点，在饲料、医药研发、污水处理及化工等领域有广泛应用。微拟球藻是海洋微藻大眼藻纲中的主要种群，能高产不饱和脂肪酸，且生长迅速，是水产养殖中常见的饵料微藻。在微拟球藻的常规培养中，藻液中存在大量不同种类的杂菌，这些菌与藻之间存在很多未知且复杂的关系，而这显然无法满足对藻类生理生化、分子遗传及藻菌关系等方面的研究，因此获得无菌纯藻具有极为重要的意义。目前，无菌藻的制备仍是藻类学研究中的一个难点。常见的制备无菌藻的技术有涂布划线法、离心洗涤技术、辐照技术、毛细吸管技术及抗生素法等，其中涂布划线法是获得纯培养物的经典方法，但该方法不普遍适用，有研究人员采用稀释结合涂布划线纯化螺旋藻但未获成功，因为该藻具有胶质鞘,且运动能力强；离心洗涤技术就是反复离心，其能在一定程度上消除细菌，但对于大多数藻类并不能实现无菌化，只能增加纯分离的可能性，因此，在无菌化研究中,离心洗涤可作为其他无菌化研究方法的辅助措施；辐照法存在繁琐、工作量大、成功率低、适用范围窄等缺点，且辐照的藻体生理特性易受影响，易突变，易出现致死效应，不能保证筛选到自然状态的藻株，难以获得理想的结果；毛细吸管技术对可能附着在藻细胞上的杂菌，毛细吸管法通常无法去除，若与显微技术结合，则对设备要求较高，操作熟练程度要求较高。相较而言，抗生素法是一种可操作性强，适用范围广的无菌藻制备技术。抗生素具有抑(杀)菌作用，采用抗生素纯化微藻，通常除了考虑对细菌的毒性，还须考虑抗生素对微藻形态或(和)生理、生化特性的可能影响，因此选用合适的抗生素是关键，理想的抗生素应具备两个特点，即抑(杀)菌活性强和对藻毒性小或促进藻生长的特点。林伟在几种海洋微藻的无菌化培养中筛选出4种抗生素，即氯霉素、青霉素、庆大霉素和卡那霉素，通过试验表明，6种微藻中褐胞藻只需要2种抗生素青霉素和庆大霉素即可实现无菌化，但培养3代培养液中又出现了细菌，但通过添加卡那霉素，且添加顺序为青霉素、庆大霉素和卡那霉素(3种抗生素)后，微小原甲藻、前沟藻及褐胞藻3种微藻培养液即可实现完全无菌化；通过抗生素混合培养试验发现，通过连续处理2次，4种微藻实现无菌化，剩余2种微藻中，微小原甲藻微藻生长受到严重抑制，培养40天死亡，褐胞藻培养液内细菌仍未有效排除，通过调整抗生素浓度，将三种抗生素合用，仍未排除了褐胞藻培养液内细菌，所以，藻类无菌化过程中抗生素种类、数量及其浓度和作用时间及添加抗生素的方法起着至关重要的作用。因此，由于微藻种类或生活环境不同，其杂菌群落亦不同，抗生素种类、数量及其浓度和作用时间及添加抗生素的方法，对获得健康的无菌藻株成为难点，对藻类实现无菌化具有不可预期性。目前还没有采用抗生素法制备无菌微拟球藻的专利报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种微拟球藻的无菌化培养方法，本专利技术选用的微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)是从青岛卓越海洋集团养殖废水中分离得到的，已于2018年8月1日保藏于中国普通微生物保藏管理中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.16188。本专利技术针对微拟球藻的生长特点，提供合适的抗生素种类及其浓度，以及抗生物的添加方式和作用时间，为获得健康的无菌微拟球藻提供方法，为后期准确研究微拟球藻奠定基础。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：本专利技术提供了制备无菌微拟球藻的抗生素，所述抗生素及其浓度分别为25～100μg/mL的氯霉素、25～150μg/mL的四环素和25～400μg/mL的头孢曲松钠。优选地，所述抗生素及其浓度分别为：100μg/mL的氯霉素、150μg/mL的四环素和400μg/mL的头孢曲松钠。本专利技术提供了上述抗生素在制备无菌微拟球藻中的应用。本专利技术提供了一种无菌微拟球藻的制备方法，具体步骤为：(1)微拟球藻的培养将微拟球藻重新转接至新鲜f/2培养基中培养，藻液与培养液以1～2:10～12比例进行转种活化；(2)无菌微拟球藻制备向上述步骤(1)活化好的微拟球藻藻液中分批依次加入抗生素处理：氯霉素(25～100μg/mL)处理1～7d，10,000rpm离心10min，收集藻体，用灭菌的新鲜f/2培养基洗涤3～4遍，转移至新鲜f/2培养基中培养1d；四环素(25～150μg/mL)处理3～7d，10,000rpm离心10min，收集藻体，用灭菌的新鲜f/2培养基洗涤3～4遍，转移至新鲜f/2培养基中培养1d；头孢曲松钠(25～400μg/mL)处理3～7d，10,000rpm离心10min，收集藻体，用灭菌的新鲜f/2培养基洗涤3～4遍，转移至新鲜f/2培养基中培养；(3)除菌效果检验取步骤(2)抗生素处理后，在无抗生素培养基中生长一周的藻液0.2～0.5mL涂布于2216E固体培养基，在28℃生化培养箱中培养3d，检测藻液中是否有菌；取步骤(2)抗生素处理后，在无抗生素培养基中生长一周的藻液1～1.5mL，加入SYBR荧光染料避光染色15min，制片后荧光显微镜观察除菌效果；取步骤(2)抗生素处理后，在无抗生素培养基中生长一周的藻液10～15mL进行PCR，用1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，检测藻液中是否有菌；(4)抗生素处理后微拟球藻生长活性检测抗生素处理完成后，定期取样，用酶标仪测定藻液的荧光强度，以检测藻类是否能正常生长。优选地，所述抗生素及其浓度分别为：100μg/mL的氯霉素、150μg/mL的四环素和400μg/mL的头孢曲松钠。优选地，步骤(1)所述培养条件为温度为24±1(℃)，光照强度为3000lux，光暗比为12L：12D，pH为6.5～7.0。优选地，(2)所述的所述抗生素及其浓度分别为：100μg/mL的氯霉素、150μg/mL的四环素和400μg/mL的头孢曲松钠。优选地，步骤(1)和(2)所述的f/2培养基组分及其配制过程如下：A：NaNO375mg/L，NaH2PO4·H2O5mg/L，Na2SiO3·9H2O30mg/L；B：f/2微量元素：Na2EDTA4.36g/L，FeCl3·6H2O3.16g/L，CuSO4·5H2O0.01g/L，ZnSO4·7H2O0.023g/L，CoCl2·6H2O0.012g/L，MnCl·4H2O0.18g/L，Na2MoO4·2H2O0.07g/L；C：f/2维生素溶液：维生素B121.0mg/L，生物素1.0mg/L，维生素B1200.0mg/L，0.2μm过滤，备用；配制过程：(1)将上述A和B各组分配好后于121℃，灭菌20min，备用；(2)取自然海水1L，0.2μm过滤后121℃，灭菌20min；待海水冷却后将A、B、C组分分别加入，即得f/2培养基。优选地，步骤(3)所述的2216E固体培养基配制过程如下：蛋白质5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.001g，0.2μm过滤陈海水1000mL，调pH7.6～7.8；上述培养基于121℃条件下灭菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备无菌微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)的抗生素，其特征在于，所述抗生素及其浓度分别为25～100μg/mL的氯霉素、25～150μg/mL的四环素和25～400μg/mL的头孢曲松钠；所述微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)，已于2018年8月1日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16188。

【技术特征摘要】
1.制备无菌微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)的抗生素，其特征在于，所述抗生素及其浓度分别为25～100μg/mL的氯霉素、25～150μg/mL的四环素和25～400μg/mL的头孢曲松钠；所述微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)，已于2018年8月1日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.16188。2.根据权利要求1所述的抗生素，其特征在于，所述抗生素及其浓度分别为：100μg/mL的氯霉素、150μg/mL的四环素和400μg/mL的头孢曲松钠。3.权利要求1或2所述的抗生素在制备无菌微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)中的应用。4.一种无菌微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)的培养：将微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)重新转接至新鲜f/2培养基中培养，藻液与培养液以1:10比例进行转种活化；(2)向步骤(1)活化好的微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)藻液中分批依次加入以下抗生素处理：首先，加入25～100μg/mL氯霉素处理1～7d，离心，收集藻体，洗涤后培养1d；其次，加入25～150μg/mL四环素处理3～7d，离心，收集藻体，洗涤后培养1d；然后，加入25～400μg/mL头孢曲松钠处理3～7d，离心，收集藻体，洗涤后培养。5.根据权利要求4所述的一种无菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永雨，曹纯洁，赵寒霜，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37