一种PAMAM与CRISPR/Cas9系统重组质粒递送纳米粒的制备方法技术方案

本发明专利技术公开了一种具有肿瘤靶向性的PAMAM与CRISPR/Cas9系统重组质粒递送纳米粒的制备方法，先将Apt羧基活化，将其与PAMAM表面的氨基反应，合成Apt‑PAMAM运载体，设计sgRNA并构建EGFR‑sgRNA/Cas9重组质粒，重组质粒与运载体通过静电作用形成Apt‑PAMAM/EGFR‑sgRNA/Cas9纳米复合物。该复合物利用其表面所修饰的Apt主动靶向肿瘤细胞表面高表达EpCAM蛋白，增加了对肿瘤组织的靶向性。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术设计EGFR‑sgRNA基因的重组质粒，以期敲除肿瘤细胞内高表达的EGFR基因，从而达到抗肿瘤的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种PAMAM与CRISPR/Cas9系统重组质粒递送纳米粒的制备方法
本专利技术属于生物
，涉及一种具肿瘤靶向性的纳米复合物Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9的制备方法。
技术介绍
卫生部和科技部发布的全国第三次死因回顾抽样调查报告显示，肺癌已跃居我国居民肿瘤死因的第1位，是我国死亡率上升速度最快、增长幅度最大的恶性肿瘤。肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC占所有肺癌的80~85%，且表皮生长因子受体（EGFR）的过度表达是导致肺癌细胞无限增殖的主要原因之一（MoschiniI,Dell'AnnaC,LosardoPL,BordiP,D'AbbieroN,TiseoM.Radiotherapyofnon-small-celllungcancerintheeraofEGFRgenemutationsandEGFreceptortyrosinekinaseinhibitors.FutureOncol.2015;11(16):2329-42.）。CRISPR-Cas9被称为第三代基因编辑技术，可通过精确定位基因组某一位点，剪断靶标DNA片段并插入、删除或替换新的基因片段高效地改造基因。CRISPR的成功实现通常需要Cas9在一组细胞中引出有效的目标基因并敲除，研究发现CRISPR对目标基因的敲除高度依赖于sgRNA引导序列的效力（YuenG,KhanFJ,GaoS,StommelJM,BatchelorE,WuX,etal.CRISPR/Cas9-mediatedgeneknockoutisinsensitivetotargetcopynumberbutisdependentonguideRNApotencyandCas9/sgRNAthresholdexpressionlevel.NucleicAcidsRes2017;45(20):12039-53.）。另有研究表明，sgRNA靶向的基因缺失与EGFR蛋白表达密切相关。因此，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除sgRNA在下调EGFR蛋白过度表达导致的肿瘤细胞无限增殖具有广泛的应用前景。聚酰胺-胺型树枝状高分子（Polyamidoamine，PAMAM）是一种新型高分子，其表面富含氨基可与带负电的核酸结合，是目前研究最多的基因载体之一。因其内部存在空腔结构，且在体内外均无毒性，被认为是一种安全的药物载体广泛应用于靶向药物输送系统（Marquez-MirandaV,AbrigoJ,RiveraJC,Araya-DuranI,AravenaJ,SimonF,etal.ThecomplexofPAMAM-OHdendrimerwithAngiotensin(1-7)preventedthedisuse-inducedskeletalmuscleatrophyinmice.IntJNanomedicine.2017;12:1985-99.）。短单链寡核苷酸（Aptamer）是一类具有特殊序列的核酸适配体，能够与EGFR表面抗原特异性结合，从而实现靶向至肿瘤细胞的作用（KangYR,ByunJS,KimTJ,ParkHG,ParkJC,BarangeN,etal.MonitoringoftheBindingBetweenEGFRProteinandEGFRAptamerUsingIn-SituTotalInternalReflectionEllipsometry.JNanosciNanotechnol.2016;16(6):6445-9.）。本专利技术制备了具肿瘤靶向性的Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物，利用短单链寡核苷酸Apt主动靶向EGFR过表达肿瘤细胞，有效地提高药物的生物利用度。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术设计sgRNA基因并构建EGFR-sgRNA重组质粒，从基因治疗层面抑制肿瘤细胞增殖，提升其临床应用价值。检索国内外相关文献和专利结果表明：具肿瘤靶向性的Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物及其制备方法，尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有靶向抗癌作用的适配体修饰树枝状高分子作为运载体介导基因输送在EGFR过表达肺癌中的作用及制备方法。通过基因重组质粒显著抑制EGFR蛋白表达，同时利用纳米载体表面的特异性适配体靶向肺癌细胞，选择性浓集于肿瘤细胞，提高生物利用度。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：（1）将PAMAM，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶于水中，滴加3’端修饰有FITC荧光的Apt（Anti-EpCAM）水溶液，室温低速搅拌反应4小时，超滤后得到Apt-PAMAM聚合物；（2）根据选定的EGFR基因设计sgRNA，对设计的sgRNA进行退火，Px459质粒进行酶切，再将sgRNA与酶切后的质粒连接，构建EGFR-sgRNA/Cas9重组质粒；（3）将10mgApt-PAMAM纳米聚合物溶于10mL二次水中，将水溶液高速搅拌，加入1mgEGFR-sgRNA/Cas9重组质粒，形成Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物。步骤(1)中Apt：EDC：NHS的质量比为15：6：4.5。步骤(1)中Apt：EDC：NHS的总浓度为1-20wt%。步骤(1)中所采用的PAMAM的代数为1代。步骤(1)中超滤管的孔径为10Kd。步骤(2)中设计的sgRNA序列为TGAACCGCACGGCGCCATGC；合成所设计sgRNA与其互补序列，并在首尾端加入酶切位点。合成序列为：EGFR-sgRNA-FCACCGTGAACCGCACGGCGCCATGCEGFR-sgRNA-RAAACGCATGGCGCCGTGCGGTTCAC步骤(2)中sgRNA退火温度梯度设置为：95℃，10min；95℃-85℃，2.5℃/s；85℃-25℃，0.25℃/s；25℃，5min。步骤(2)中Px459质粒的酶切条件为37℃，15min。步骤(2)中sgRNA与酶切后质粒连接的条件为16℃水浴过夜12-24h。步骤(3)中Apt-PAMAM和EGFR-sgRNA/Cas9重组质粒的反应条件为低速搅拌过夜12-24h。本专利技术的原理在于：第一，利用纳米载体表面的特异性适配体选择性地浓集于肿瘤细胞，有效地提高了药物的生物利用度；第二，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建EGFR-sgRNA重组质粒，显著下调EGFR蛋白表达，抑制肿瘤细胞增殖；第三，利用纳米级运载体PAMAM的被动靶向作用，增强Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物在肿瘤组织的滞留效应。本专利技术的优点在于：第一，本专利技术采用树枝状大分子PAMAM作为载体，它能与能够特异性识别EGFR过表达肿瘤细胞的适配体共价偶联，形成Apt-PAMAM运载体，通过Apt的主动靶向作用提高Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物的肿瘤靶向作用。第二，本专利技术采用CRISPR-Cas9基因编辑技术设计sgRNA并构建EGFR-sgRNA重组质粒，重组质粒与Apt-PAMA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有肿瘤靶向性的Apt‑PAMAM/ EGFR‑sgRNA/Cas9纳米复合物的制备方法，其特征在于：先将Apt表面的羧基活化，再将Apt与PAMAM表面的氨基通过酰胺键连接形成Apt‑PAMAM运载体，设计EGFR‑sgRNA并构建重组质粒，并将其装载在Apt‑PAMAM纳米中制备获得Apt‑PAMAM/EGFR‑sgRNA/Cas9纳米复合物。

【技术特征摘要】
1.一种具有肿瘤靶向性的Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物的制备方法，其特征在于：先将Apt表面的羧基活化，再将Apt与PAMAM表面的氨基通过酰胺键连接形成Apt-PAMAM运载体，设计EGFR-sgRNA并构建重组质粒，并将其装载在Apt-PAMAM纳米中制备获得Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物。2.根据权利要求1所述的Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：（1）将PAMAM，N-羟基琥珀酰亚胺和1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于滴加Apt的水溶液中，室温低速搅拌反应4小时，随后用超滤管滤去未反应的PAMAM，得到Apt-PAMAM聚合物；（2）根据选定的EGFR基因设计sgRNA，对设计的sgRNA进行退火，Px459质粒进行酶切，再将sgRNA与酶切后的质粒连接，构建EGFR-sgRNA/Cas9重组质粒；（3）将Apt-PAMAM纳米聚合物溶于水中，将水溶液高速搅拌，加入EGFR-sgRNA/Cas9重组质粒，形成Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物。3.根据权利要求2所述的Apt-PAMAM/EGFR-sgRNA/Cas9纳米复合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所采用的PAMAM的代数为1代；Apt与PAMAM的摩尔比为1：10。4.根据权利要求2所述的Apt-PA...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵敬伟，江佳丽，张冰晨，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35