细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体，包括步骤：采用pReceiver‑M98质粒，构建出用EGFP标记LRP4的完整开放阅读框架的真核表达载体，得到重组质粒；将重组质粒转染培养好的HEK293T细胞，得到携带重组质粒的HEK293T细胞；将携带重组质粒的表达细胞依次进行培养、细胞固定、封闭和孵育，然后采用荧光显微镜进行观察，检测出低密度脂蛋白受体相关蛋白。本发明专利技术提供的采用细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体，因抗原抗体一一对应，特异性几乎达到100％，为重症肌无力患者的诊治提供了必要的实验依据，对重症肌无力患者的诊治提供了新的方向，具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体
本专利技术涉及医学
，具体涉及一种细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体。
技术介绍
自1672年重症肌无力(MG)被发现以来，其发病机制通常被认为主要与乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)介导的体液免疫息息相关，但是随着众多科学家对MG免疫学发病机制的深入研究，现在普遍认为多种肌肉抗原(例如：MuSK-Ab)、补体系统、抗原特异性T淋巴细胞、细胞因子以及胸腺等均对MG的发病起到了重要作用。对MG患者进行血清学抗体检测及其免疫学致病机制的研究已经逐渐成为世界范围内该病讨论的热点问题，约有85％的MG患者血清中可检测出AChR-Ab；余下的MG患者约有70％血清中可以检测出肌肉特异性酪氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)。实验证实，在贵州高海拔多民族聚集地区所收集的共计116例MG患者中，AChR-Ab单阳性率为50.0％。其中女性占大多数；分型以眼肌型及轻度全身型为主。56名未检测出AChR-Ab抗体的MG患者中仅有6人(10.7％)检测出MuSK-Ab阳性。这个比例远低于欧美人种的数据，但与国内相关资料接近。虽然大部分的MG患者可检测出AChR-Ab和MuSK-Ab，但仍然有一部分病人(10％左右)体内无法检测出上述两种抗体，他们体内是否存在未知的致病性抗体尚不明确，这种类型重症肌无力患者的出现给临床诊治带来了一定的困难。2011年，Higuchi等首次在dSN-MG患者血清中检测出了LRP4-Ab，故认为新发现的LRP4是dSN-MG患者体内自身抗体的靶目标。这些抗体属于IgG1，它可能通过抑制神经元释放的Agrin与胞外LRP4的结合、介导NMJ传递障碍而致病。同时，LRP4-Ab激活补体系统导致体内发生自身抗原抗体免疫反应，Agrin-LRP4-MuSK信号通路受到破坏而致病。Higuchi的实验检测发现300例dSN-MG患者中共有9例LRP4-Ab阳性(3％)。Pevzner等共检测13例dSN-MG，7例LRP4-Ab呈明显阳性(阳性率约为53.8％)；Tzartos的研究表明，约有9.2％的dSN-MG患者血清中检测出LRP4-Ab；Georgios等检测并分析了3例同人种的LRP4-Ab阳性患者的人口学特点、临床表现及疗效。这些发现均表明LRP4-Ab可能是dSN-MG患者新的诊断标志物。故中国人中该抗体的阳性率为多少，以及检测方法是我们研究的目标。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的在于提供一种细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体，以提高检测方法的特异性，为重症肌无力患者的诊治提供了必要的实验依据，对重症肌无力患者的诊治提供了新的方向，具有重要的意义。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术提供了一种检测低密度脂蛋白受体相关蛋白的方法，包括步骤：构建重组质粒；将重组质粒转染培养好的HEK293T细胞，得到携带重组质粒的HEK293T细胞；将携带重组质粒的表达细胞(HEK293T细胞)依次进行培养、细胞固定、封闭和孵育，然后采用荧光显微镜进行观察，检测出低密度脂蛋白受体相关蛋白。优选地，重组质粒，是采用pReceiver-M98质粒，构建出用EGFP标记LRP4的完整开放阅读框架的真核表达载体。绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)之所以能够发光是因为含有色基，GFP的色基是由丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸(Ser/Tyr/Gly)形成的特殊结构“环化三肽”，该结构能够吸收蓝光(最大激发波长是395nm，其发射波长的峰点是在509nm)，当受到紫外线照射时即可激活，发射绿色(或黄绿色)荧光。EGFP的色基与CFP的有所不同，特殊结构“环化三肽”出现了氨基酸的取代，最大激发波长偏移至490nm附近。因此，EGFP获得的荧光信号要比GFP更为明亮，发射出更强的绿色荧光。试验中将EGFP的基因与目的基因构建成所谓的“嵌合基因”，致使其表达产物重组蛋白带有荧光标记。用质粒重组的方法很方便地研究目的基因，特别是表达、定位和运转的过程。pReceiver-M98重组质粒既可以在大肠杆菌又可以在哺乳动物细胞中复制，所以厂家可以在大肠杆菌中完成融合基因的构建过程，购入后，转染细胞可以在细胞中表达，也可以筛选压力下完成稳定复制。pReceiver-M98重组质粒插入的目的基因，即LRP4的ORF区域位于EGFP基因上游。优选地，培养具体包括步骤：将经多聚赖氨酸处理的细胞爬片置于24孔细胞培养板中，然后加入携带重组质粒的HEK293T细胞进行培养。优选地，细胞固定是当携带重组质粒的HEK293T细胞的密度为70％～80％时，采用4％多聚甲醛固定液进行固定。优选地，细胞固定的时间为16～20min。优选地，封闭采用的封闭液是含质量分数为5％的羊血清白蛋白的PBS溶液。优选地，封闭的时间为2.5～3.0h。优选地，孵育包括一抗孵育和荧光二抗孵育。优选地，一抗孵育是采用稀释的待测血清孵育过夜；孵育的温度为4℃；稀释是根据封闭液倍增稀释法进行。优选地，荧光二抗孵育是采用Alex568标记的山羊抗人IgG避光室温孵育2.5～3.0h。本专利技术提供的技术方案，具有如下的有益效果：本专利技术提供的采用细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体，因抗原抗体一一对应，特异性几乎达到100％，为重症肌无力患者的诊治提供了必要的实验依据，对重症肌无力患者的诊治提供了新的方向，具有重要的意义。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术中的细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体的流程示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平本专利技术提供一种检测低密度脂蛋白受体相关蛋白的方法，包括步骤：S1(构建重组质粒)：采用pReceiver-M98质粒，构建出用EGFP标记LRP4的完整开放阅读框架的真核表达载体，得到重组LRP4全长并携带EGFP的质粒；S2(质粒转染)：将重组LRP4全长并携带EGFP的质粒转染培养好的HEK293T细胞，得到携带重组质粒的HEK293T细胞；S3(培养)：将经多聚赖氨酸处理的细胞爬片置于24孔细胞培养板中，然后加入携带重组质粒的HEK293T细胞进行培养；S4(固定)：当携带重组质粒的HEK293T细胞的密度为70％～80％时，采用4％多聚甲醛固定液室温固定16～20min；S5(封闭)：细胞固定完毕后，采用封闭液室温封闭2.5～3.0h；其中，封闭液是含质量分数为5％的羊血清白蛋白的PBS溶液；S6(一抗孵育)：封闭完毕后，加入采用封闭液倍增稀释法稀释的待测血清，然后4℃孵育过夜；S7(荧光二抗孵育)：一抗孵育完毕后，采用Alex568标记的山羊抗人IgG避光室温孵育本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测低密度脂蛋白受体相关蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：构建重组质粒；将所述重组质粒转染培养好的HEK293T细胞，得到携带重组质粒的HEK293T细胞；将所述携带重组质粒的HEK293T细胞依次进行培养、细胞固定、封闭和孵育，然后采用荧光显微镜进行观察，检测出低密度脂蛋白受体相关蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种检测低密度脂蛋白受体相关蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：构建重组质粒；将所述重组质粒转染培养好的HEK293T细胞，得到携带重组质粒的HEK293T细胞；将所述携带重组质粒的HEK293T细胞依次进行培养、细胞固定、封闭和孵育，然后采用荧光显微镜进行观察，检测出低密度脂蛋白受体相关蛋白。2.根据权利要求1所述的检测低密度脂蛋白受体相关蛋白的方法，其特征在于：所述重组质粒，是采用pReceiver-M98质粒，构建出用EGFP标记LRP4的完整开放阅读框架的真核表达载体。3.根据权利要求1所述的检测低密度脂蛋白受体相关蛋白的方法，其特征在于，所述培养具体包括步骤：将经多聚赖氨酸处理的细胞爬片置于24孔细胞培养板中，然后加入所述携带重组质粒的HEK293T细胞进行培养。4.根据权利要求1所述的检测低密度脂蛋白受体相关蛋白的方法，其特征在于：所述细胞固定是当携带重组质粒的HEK293T细胞的密度为70％～80％时...

【专利技术属性】
技术研发人员：楚兰，李媛，张艺凡，贺电，蔡刚，
申请(专利权)人：楚兰，李媛，张艺凡，贺电，蔡刚，
类型：发明
国别省市：贵州,52