一种具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体及其制备方法和应用，制备方法为：采用糖类衍生物对细胞外泌体表面进行修饰，即得到具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体。本发明专利技术创造性地通过特定的糖类衍生物对细胞外泌体表面进行修饰，制得具有靶向肿瘤细胞作用的外泌体，能在特定的肿瘤部位富集并对肿瘤细胞进行杀伤，达到有效治疗肿瘤疾病的效果，能够广泛应用在制备抗肿瘤药物技术上，从而有效增强抗药物的抗肿瘤药效，对治疗肿瘤疾病有着积极的作用，具有重要的应用价值和巨大的社会效益。

【技术实现步骤摘要】
一种具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医学
，特别涉及一种具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
外泌体(Exosomes)是细胞经过"内吞-融合-外排"等一系列调控过程而形成的直径在30～150nm的圆形单层膜结构的细胞外小囊泡。外泌体由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中，可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息转导中起重要作用。外泌体的发现丰富了研究者们对细胞间通讯方式的认识，加深了对机体生理、病理过程的理解，2013年诺贝尔生物/医学奖授予了三位在细胞囊泡方面贡献突出的科学家，使外泌体的研究达到全新的高度。自然杀伤细胞(英文：naturalkillercell，简称NK细胞)是人体中参与免疫反应的一类淋巴细胞，在人体免疫监视中占有重要地位，是机体识别自己和非己的关键效应细胞。NK细胞分泌的外泌体不仅含有NK细胞标志物如CD56，同时含有诱导肿瘤细胞凋亡的FasL及直接杀伤肿瘤细胞的穿孔素等裂解蛋白。其中，NK92及其它通过PBMC(外周血单个核细胞，英文名Peripheralbloodmononuclearcell,简称PBMC)分离且体外激活的NK细胞所分泌的外泌体，对血液肿瘤细胞系(Jurkat,K562,DAUDI等)及实体瘤细胞系(SKBR3，SupB15,NALM-6,CHLA-136,CHLA-255，MCF7等)均有杀伤功能(Wenetal.,2017)。细胞免疫治疗，尤其是CAR-T免疫治疗是目前肿瘤治疗的重要方向，但由于机体存在生物屏障的缘故，细胞不能透过生物屏障导致其对实体肿瘤的效果较差。外泌体能够轻易穿透机体生物屏障，有效到达肿瘤部位，因而应用NK细胞分泌的外泌体进行肿瘤治疗受到越来越广泛的关注。然而，NK细胞所分泌的外泌体不具备靶向性，不能在特定的肿瘤部位富集，成为NK细胞外泌体治疗肿瘤的一大技术障碍。
技术实现思路
为解决上述
技术介绍
中提到的问题，本专利技术提供一种具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体的制备方法：采用糖类衍生物对细胞外泌体表面进行修饰，即得到具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体；所述糖类衍生物的结构式为：其中，所述R1、R2、R3为H原子、羟基中的一种，或为靶向CD169、CD22、其它CD抗原分化簇的苯环类取代基中的一种，或为靶向生物素受体的生物素类取代基，或为靶向叶酸受体的叶酸类取代基、或为靶向整合素的RGD类取代基、或其它siglec类的凝集素。进一步地，所述靶向CD169或CD22或其它CD抗原分化簇的苯环类取代基包括所述靶向生物素受体的生物素类取代基包括：所述靶向叶酸受体的叶酸类取代基包括：所述靶向整合素的RGD类取代基包括：进一步地，所述外泌体包括NK92细胞外泌体、NK细胞外泌体和其它对肿瘤细胞具有杀伤性能的细胞外泌体。进一步地，包括以下制备步骤：步骤a、将含有糖类衍生物的无外泌体α-MEM培养基对NK细胞进行培养；步骤b、收集步骤a培养后的细胞培养液，提取外泌体粗提液；步骤c、将外泌体粗提液离心分离后收集沉淀，用PBS缓冲溶液重悬沉淀即获得具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体。进一步地，步骤a中，获得NK细胞的方法包括：对人体外周血细胞进行离心初分离，然后采用NK细胞提取试剂盒进行分离；对分离的细胞进行分选，选取表型为NKp46+,CD3-或CD56+的细胞，并在IMDM培养基中悬浮培养，即获得所需的NK细胞。进一步地，所述IMDM培养基包含10％人血清、1％非必须氨基酸和1％丙酮酸钠。进一步地，步骤a中，获得NK细胞的方法包括：采用ATCC来源的NK-92细胞系，在37℃、5％CO2条件下，于α-MEM培养基中培养，即获得所需的NK细胞。进一步地，所述α-MEM培养基包含12.5％新生牛血清、12.5％马血清和100U/ml重组人白细胞介素-2。进一步地，步骤b中，提取外泌体粗提液的方法包括：收集细胞培养液，采用500g离心收集细胞培养液上清液于离心管中，再在4℃条件下以500g离心后，收集上清液；将收集的上清液经4℃条件下，以3000g离心去除细胞碎片和蛋白聚合物后，再次收集上清液，过0.22um滤膜获即得到外泌体粗提液。本专利技术还提供一种根据如上任意所述制备方法所制备的具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体。本专利技术还提供一种根据如上任意所述制备方法所制备的具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体在制备抗肿瘤药物上的应用。本专利技术中，所述的糖类衍生物分子都可以经胞内唾液酸代谢途径最终呈递到外泌体表面。本专利技术创造性地通过特定的糖类衍生物对细胞外泌体表面进行修饰，制得具有靶向肿瘤细胞作用的外泌体，能在特定的肿瘤部位富集并对肿瘤细胞进行杀伤，达到有效治疗肿瘤疾病的效果，能够广泛应用在制备抗肿瘤药物技术上，从而有效增强抗药物的抗肿瘤药效，对治疗肿瘤疾病有着积极的作用，具有重要的应用价值和巨大的社会效益。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为证明通过本专利技术的制备方法可以将提供的糖类衍生物通过细胞代谢途径修饰到外泌体上实验结果图；图2为实施例a提供的糖类衍生物修饰后的NK92的肿瘤细胞杀伤实验结果图；图3为实施例a提供的糖类衍生物修饰后的NK的肿瘤细胞杀伤实验结果图；图4为实施例b提供的糖类衍生物修饰后的NK92的肿瘤细胞杀伤实验结果图；图5为实施例b提供的糖类衍生物修饰后的NK的肿瘤细胞杀伤实验结果图；图6为实施例c提供的糖类衍生物修饰后的NK92的肿瘤细胞杀伤实验结果图；图7为实施例c提供的糖类衍生物修饰后的NK的肿瘤细胞杀伤实验结果图；图8为实施例e提供的BPCA-Neu5AC修饰后的NK92的肿瘤细胞杀伤实验结果图；图9为实施例e提供的BPCA-Neu5AC修饰后的NK的肿瘤细胞杀伤实验结果图；图10为实施例a提供的糖类衍生物修饰NK92细胞外泌体的体内实验结果图；图11为实施例b提供的糖类衍生物修饰NK92细胞外泌体的体内实验结果图；图12为实施例c提供的糖类衍生物修饰NK92细胞外泌体的体内实验结果图；图13为实施例e提供的BPCA-Neu5AC提供的糖类衍生物修饰NK92细胞外泌体的体内实验结果图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。专利技术提供一种具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体的制备方法：采用糖类衍生物对细胞外泌体表面进行修饰，即得到具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体；其中，以唾液酸类为主体的糖类衍生物的结构式为：以乙酰甘露糖类乙酰甘露糖类为主体的糖类衍生物的结构式为其中，所述R1、R2、R3为H原子、羟基中的一种，或为靶向CD169、CD22、其它CD抗原分化簇的苯环类取代基中的一种，或为靶向本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体的制备方法，其特征在于：采用糖类衍生物对细胞外泌体表面进行修饰，即得到具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体；所述糖类衍生物的结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体的制备方法，其特征在于：采用糖类衍生物对细胞外泌体表面进行修饰，即得到具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体；所述糖类衍生物的结构式为：其中，所述R1、R2、R3为H原子、羟基中的一种，或为靶向CD169、CD22、其它CD抗原分化簇的苯环类取代基中的一种，或为靶向生物素受体的生物素类取代基，或为靶向叶酸受体的叶酸类取代基、或为靶向整合素的RGD类取代基、或其它siglec类的凝集素。2.根据权利要求1所述的具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体的制备方法，其特征在于，所述靶向CD169或CD22或其它CD抗原分化簇的苯环类取代基包括所述靶向生物素受体的生物素类取代基包括：所述靶向叶酸受体的叶酸类取代基包括：所述靶向整合素的RGD类取代基包括：3.根据权利要求1所述的具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体的制备方法，其特征在于：所述外泌体包括NK92细胞外泌体、NK细胞外泌体和其它对肿瘤细胞具有杀伤性能的细胞外泌体。4.根据权利要求1所述的具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：步骤a、将含有糖类衍生物的无外泌体α-MEM培养基对NK细胞进行培养；步骤b、收集步骤a培养后的细胞培养液，提取外泌体粗提液；步骤c、将外泌体粗提液离心分离后收集沉淀，用PBS缓冲溶液重悬沉淀即获得具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体。5.根据权利要求4所述的具有靶向肿瘤细胞功能的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤a中，获得NK细胞的方法包括：对人体...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯继良，田云鹏，孙坪，李柱，
申请(专利权)人：厦门诺康得生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35