硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞在膈肌功能障碍中的应用制造技术

本发明专利技术提供硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞在膈肌功能障碍中的应用。该应用具体为培养大鼠成肌细胞L6细胞，待L6细胞生长至对数期更换无血清培养基，然后加入细菌内毒素脂多糖，并快速加入硫化氢供体继续培养；通过实验检测获取的指标用于阐明脓毒症诱导的膈肌功能障碍的机制。本发明专利技术通过给予H2S供体NaHS时可促进LPS诱导的L6细胞的增殖并抑制其凋亡，且具有抗炎、抗氧化等作用，显著改善膈肌功能障碍，降低脓毒症大鼠的膈肌炎症；构建的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型对膈肌功能障碍研究和预防起到指导性作用。

Hydrogen sulfide induces lipopolysaccharide induced L6 cells in diaphragm dysfunction

The invention provides hydrogen sulfide inducing lipopolysaccharide induced L6 cells in diaphragm dysfunction. The specific application is to culture rat myoblasts L6 cells and replace serum-free medium when L6 cells grow to logarithmic phase, then add bacterial endotoxin lipopolysaccharide, and quickly add hydrogen sulfide donor for further culture. The obtained indicators are used to elucidate the mechanism of sepsis-induced diaphragmatic dysfunction. The invention can promote LPS-induced L6 cell proliferation and inhibit apoptosis by giving H2S donor NaHS, and has anti-inflammatory and anti-oxidative effects, significantly improve diaphragm dysfunction and reduce diaphragm inflammation in sepsis rats; The diaphragm dysfunction model of sepsis rats constructed plays a role in diaphragm dysfunction research and prevention. Guiding role.

【技术实现步骤摘要】
硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞在膈肌功能障碍中的应用
本专利技术属于生物制药
，具体涉及硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞在膈肌功能障碍中的应用。
技术介绍
膈肌位于胸腹腔之间，是主要的呼吸肌，呼吸功能的60％～80％由膈肌完成，故其收缩性能显著影响着呼吸效率。膈肌功能障碍是全球面临的重要临床问题，但其发病率和影响往往被忽视，且防治措施较少。感染是危重病人膈肌功能障碍的主要危险因素，脓毒症可诱导膈肌功能障碍。近年来，硫化氢(hydrogensulfide，H2S)被认为是继NO和CO之后的第三种气体信号分子，参与机体多个系统的生理病理调节。在呼吸系统中，H2S对调节肺循环、气道张力、纤维化、细胞增殖或凋亡、氧化应激及炎症等有重要功能。H2S对平滑肌收缩性的影响在全身不同器官中都有明确的研究和报道，如血管、胃肠道、气管、膀胱、输卵管和子宫等。然而，H2S对横纹肌收缩性的影响和对脓毒症诱导的膈肌功能障碍的研究机理却鲜有报道。
技术实现思路
基于现有技术中脓毒症诱导发生膈肌功能障碍的研究的局限性，本专利技术的目的在于提供硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞在膈肌功能障碍中的应用；本专利技术的目的还在于提供一种非治疗目的的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型的构建方法和构建获得的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型。通过给予H2S供体NaHS时可促进细菌内毒素脂多糖LPS诱导的L6细胞的增殖并抑制其凋亡，且具有抗炎、抗氧化等作用，显著改善膈肌功能障碍，降低脓毒症大鼠的膈肌炎症。本专利技术的目的通过以下技术方案得以实现：一方面，本专利技术提供硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞在膈肌功能障碍中的应用。上述的应用中，优选地，其包括以下步骤：培养大鼠成肌细胞L6细胞，待L6细胞生长至对数期更换无血清培养基，然后加入细菌内毒素脂多糖(LPS)，并快速加入硫化氢供体继续培养；通过实验检测获取的指标用于阐明脓毒症诱导的膈肌功能障碍的机制。上述的应用中，优选地，实验检测可以包括蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法、EDU法、MTS法、荧光法、分光光度法、TUNEL法和ELISA法等中的一种或多种的组合。上述的应用中，优选地，所述细菌内毒素脂多糖的用量可以为250μg/mL。上述的应用中，优选地，所述硫化氢供体为NaHS。上述的应用中，优选地，所述硫化氢供体的用量可以为100μmol/L。上述的应用中，优选地，通过蛋白免疫印迹法检测获取硫化氢合成酶CSE、CBS和3-MST蛋白表达量的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞对L6细胞硫化氢合成酶表达量的影响。通过该检测发现L6细胞中硫化氢合成酶的表达水平明显降低，且L6细胞及细胞上清液中硫化氢的含量也明显降低；此应用能够阐明LPS导致的细胞活力的下降可能与内源性硫化氢的降低有关。上述的应用中，优选地，通过MTS法检测获取L6细胞活力的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞对L6细胞活力的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞能够提高L6细胞的活力。上述的应用中，优选地，通过EDU法检测获取L6细胞增殖率的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞对L6细胞增殖能力的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞能够提高L6细胞的增殖能力。上述的应用中，优选地，通过TUNEL法和蛋白免疫印迹法检测获取L6细胞凋亡率和凋亡信号通路蛋白的表达量的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞对L6细胞凋亡的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞能够降低L6细胞的凋亡水平。上述的应用中，优选地，通过荧光法、分光光度法和蛋白免疫印迹法检测获取L6细胞活性氧含量、CAT活性、SOD活性、GSH-Px活性和MAPK信号通路蛋白ERK、p38和JNK的表达量的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞对L6细胞抗氧化能力的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞能够介导L6细胞中ROS/MAPK途径从而减少L6细胞的凋亡。上述的应用中，优选地，通过ELISA法和蛋白免疫印迹法检测获取L6细胞的MCP-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18表达水平的指标，以及p50、p-p65表达水平的指标和p-p65/p65比率的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞对L6细胞分泌炎性因子的水平和TLR4/NF-κB信号通路蛋白的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞能够抑制TLR4/NF-κB信号转导途径来缓解LPS诱导的炎症。另一方面，本专利技术还提供一种非治疗目的的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型的构建方法，其包括以下步骤：向大鼠腹腔中注入细菌内毒素脂多糖，随后立即向腹腔中注入硫化氢供体；培养大鼠构建获得脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型。上述的方法中，优选地，所述细菌内毒素脂多糖的注入量为5mg/kg。上述的方法中，优选地，所述硫化氢供体为NaHS。上述的方法中，优选地，所述硫化氢供体的注入量为5mg/kg。再一方面，本专利技术还提供上述的构建方法获得的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型。通过构建的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型的大鼠的检测指标能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导膈肌功能障碍能够阻止LPS诱导的脓毒症大鼠膈肌中MHCslow和MHCfastCSA的减少，同时硫化氢能够起到一定的保护作用，显著降低炎性细胞因子，改善由LPS诱导的膈肌损伤，构建的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型对膈肌功能障碍研究和预防起到指导性作用。本专利技术的硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞在膈肌功能障碍中的应用通过给予H2S供体NaHS时可促进LPS诱导的L6细胞的增殖并抑制其凋亡，且具有抗炎、抗氧化等作用，显著改善膈肌功能障碍，降低脓毒症大鼠的膈肌炎症；构建的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型对膈肌功能障碍研究和预防起到指导性作用。附图说明图1为本专利技术实施例2中蛋白质免疫印迹检测细胞中H2S合成酶的表达量；图2为本专利技术实施例2中ELISA法检测细胞内及上清液中H2S的浓度；图3为本专利技术实施例3中EDU法检测各组细胞增殖率；图4为本专利技术实施例4中采用MTS法时H2S对LPS诱导的L6细胞活力的影响；图5为本专利技术实施例5中TUNEL法检测各组细胞凋亡率；图6为本专利技术实施例5中蛋白免疫印迹检测凋亡蛋白表达水平；图7为本专利技术实施例6中活性氧水平对比实验数据图；图8为本专利技术实施例6中分光光度法检测细胞内的抗氧化酶活性数据图；图9为本专利技术实施例6中MAPK信号通路蛋白的表达水平实验数据图；图10为本专利技术实施例7中细胞上清中炎性因子水平实验数据图；图11为本专利技术实施例7中TLR4/NF-κB信号通路蛋白的表达水平实验数据图；图12为本专利技术实施例8中各组大鼠给药前后0-24h后的体重；图13为本专利技术实施例8中各组大鼠24h后的肌条质量；图14为本专利技术实施例8中各频率刺激下的各组大鼠膈肌收缩张力-频率曲线图；图15为本专利技术实施例8中各组大鼠最大强直收缩力测试数据图；图16为本专利技术实施例8中各组大鼠单收缩张力测试数据图；图17为本专利技术实施例8中各频率刺激下的各组大鼠肌条疲劳指数图；图18为本专利技术实施例8中膈肌肌条张力最大上升速率及张力最大下降速率的测试数据；图19为本专利技术实施例8中快肌纤维和慢肌纤维的免疫组化数据图；图20为本专利技术实施例8中快肌纤维和慢肌纤维的横截面积的统计数据图；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞在膈肌功能障碍中的应用。

【技术特征摘要】
1.硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞在膈肌功能障碍中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其包括以下步骤：培养大鼠成肌细胞L6细胞，待L6细胞生长至对数期更换无血清培养基，然后加入细菌内毒素脂多糖，并快速加入硫化氢供体继续培养；通过实验检测获取的指标用于阐明脓毒症诱导的膈肌功能障碍的机制。3.根据权利要求2所述的应用，其中，实验检测包括蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法、EDU法、MTS法、荧光法、分光光度法、TUNEL法和ELISA法中的一种或多种的组合。4.根据权利要求2或3所述的应用，其中，所述细菌内毒素脂多糖的用量为250μg/mL；优选地，所述硫化氢供体为NaHS；优选地，所述硫化氢供体的用量为100μmol/L。5.根据权利要求3所述的应用，其中，通过蛋白免疫印迹法检测获取硫化氢合成酶CSE、CBS和3-MST蛋白表达量的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞对L6细胞硫化氢合成酶表达量的影响；优选地，通过MTS法检测获取L6细胞活力的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞对L6细胞活力的影响。6.根据权利要求3所述的应用，其中，通过EDU法检测获取L6细胞增殖率的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导L6细胞对L6细胞增殖能力的影响；优选地，通过TUNEL法和蛋白免疫印迹法检...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴东栋，任志广，李涛，卫文强，沈永红，陆丹，刘诗语，高荧苒，洪亚，潘韦彤，郭建成，姬新颖，
申请(专利权)人：吴东栋，任志广，李涛，卫文强，沈永红，陆丹，刘诗语，高荧苒，洪亚，潘韦彤，郭建成，姬新颖，
类型：发明
国别省市：北京,11