基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置，属于显微光谱成像和分析化学技术领域。本方法利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光，通过采用时空聚焦在样品中产生聚焦线、收集所激发荧光并采用共焦光学狭缝滤除杂散光、采集荧光光谱信息完成样品的光谱信息(x,λ)获取，最后由三维空间扫描与延时扫描获取样品(x,λ,y,z,t)五维信息。本装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、以及滤波与同步光谱共焦探测系统，且滤波与同步光谱共焦探测系统中的光谱信息获取与结合时空聚焦技术的线扫描系统中线扫描触发信号同步。本发明专利技术具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、高光谱分辨率等优点。

Wide field of view hyperspectral microscopic imaging method and device based on spatio-temporal focusing

The invention discloses a wide field of view tomography hyperspectral microscopic imaging method and device based on space-time focusing, belonging to the technical field of microscopic spectral imaging and analytical chemistry. In this method, ultrashort pulsed laser is produced by using ultrashort pulsed laser source. By using space-time focusing to generate focus lines in the sample, collecting stimulated fluorescence, filtering stray light by confocal optical slit and collecting fluorescence spectrum information, the spectral information (x, lambda) of the sample is obtained. Finally, the spectral information (x, lambda) of the sample is obtained by three-dimensional space scanning and delayed scanning. Take the five dimensional information of samples (x, lambda, y, Z, t). The device includes ultrashort pulse laser source and beam transformation system, line scanning system based on spatiotemporal focusing, optical microscopy system, filtering and synchronous spectral confocal detection system, and spectral information acquisition in filtering and synchronous spectral confocal detection system and line scanning contact in line scanning system combined with spatiotemporal focusing technology. Signal synchronization. The invention has the advantages of wide field of view, high spatial resolution, high temporal resolution and high spectral resolution.

【技术实现步骤摘要】
基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置
本专利技术涉及一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置，属于显微光谱成像和分析化学

技术介绍
超光谱显微成像(HyperspectralMicroscopy)在生物医学研究领域有着重要应用，尤其是在临床疾病诊断、术中图像导航等领域日益受到人们的广泛重视。采用超光谱显微成像技术获取空间可分辨的光谱信息，可为疾病诊断提供生物组织的生理参数、形貌及组份等信息。目前，采用超光谱显微成像技术，已可实现对多种癌症的非侵入式检测。从本质上讲，超光谱显微成像技术是在显微成像的基础上获取更高维信息(即光谱信息)的技术。依据显微成像技术的实现方式，当前的超光谱显微成像技术可分为基于普通宽场显微的超光谱显微成像技术、基于共聚焦扫描的超光谱显微成像技术等。前者可快速并行获取宽视场内的光谱信息，但限于普通宽场显微不具备层析能力、易受组织散射造成信号串扰等缺点，该技术仅适用于透明生物样本。后者基于共聚焦原理，一定程度上抑制了组织散射的影响且获得了轴向分辨能力，但由于需要进行逐点扫描成像，成像速度受到限制。此外，近年来还出现了基于光片显微的超光谱显微成像技术，遗憾的是该技术同样不适于散射性组织成像。为了克服生物组织散射的影响并提高成像穿透深度，人们将非线性光学显微技术引入到超光谱显微成像中，发展了基于非线性光学效应的超光谱显微技术，并广泛应用于生物医学研究。由于普通非线性光学显微技术大多仍采用点扫描方式以克服组织散射的影响，成像的速度及通量势必受到影响。另一方面，采用面激发的非线性光学显微虽然免除了逐点扫描导致的速度瓶颈，但所激发信号经组织散射后串扰严重，不适于散射组织光谱成像。采用线扫描方式的普通非线性光学显微技术可以在成像速度与抑制散射影响二者之间折衷，但是该方法相对于点扫描方式所获得的轴向分辨率降低，亦非理想的选择。因此，目前需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何能够创新地提出一种有效措施，以解决现有技术中存在的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服已有技术的不足之处，提供一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置。本专利技术适用于散射性生物组织成像，可提高成像速度和通量，并具有高轴向分辨率。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提出的一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，设定沿激光光谱方向为λ轴，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，设定实现沿样品纵向线扫描的振镜偏转角步长，设定实现沿样品轴向扫描的显微物镜轴向步长，根据目标扫描区域的大小设定光谱信息采集周期和扫描总时长；2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线；4)通过非线性光学效应在步骤3)的聚焦线上激发出荧光信号，该荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，然后由滤波片滤除反射的超短脉冲激光并由共焦光学狭缝滤除样品散射引起的杂散光，得到样品的条形发射荧光；5)通过色散元件将得到的条形发射荧光进行光谱展开，由面阵探测器进行光谱信息采集，得到样品的(x,λ)二维信息；同时，根据设定的振镜偏转角步长改变线扫描的偏转角，获得样品的(x,λ,y)三维信息，直至扫描遍历XY目标区域，完成样品二维平面不同位置光谱信息的获取；其中，所述面阵探测器的探测区域大小完全覆盖所述条形发射荧光的展开程度，且所述面阵探测器与振镜的触发信号同步；6)根据设定的显微物镜轴向步长改变聚焦线的深度，获得样品的(x,λ,y,z)四维信息，直至扫描遍历XYZ目标区域，完成不同深度光谱信息的获取，得到样品内三维空间不同位置的光谱信息；当前扫描周期结束，执行步骤7)；7)根据设定的光谱信息采集周期重复步骤3)～步骤6)进行延时超光谱显微成像，获得样品的(x,λ,y,z,t)五维信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场层析超光谱显微成像。本专利技术还提出一种根据上述基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法的装置，其特征在于，包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、以及滤波与同步光谱共焦探测系统；其中，所述超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整所述激发脉冲光光束尺寸；所述基于时空聚焦的线扫描系统，置于所述光束变换系统之后，包括光学衍射元件、透镜及光学扫描元件，所述光学衍射元件和所述光学扫描元件分别置于所述透镜的物方焦面与像方焦面；所述光学衍射元件用于引入激发脉冲光束的角色散，所述光学扫描元件用于引入激发脉冲光束的可变偏转角；所述光学显微系统，置于所述光学扫描元件之后，包括透镜组及显微物镜，由所述透镜组连接所述光学扫描元件和显微物镜后入瞳面，构成4f系统，该光学显微系统用于在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以激发组织样品并基于非线性光学效应产生发射荧光；所述滤波与同步光谱共焦探测系统，置于所述基于时空聚焦的线扫描系统中发射荧光经所述显微物镜收集并反向传输的光学扫描元件之后，包括滤波片、共焦光学狭缝及光谱仪，用于选出样品的发射荧光信号并进行光谱信息采集；所述光谱仪的信息获取与所述基于时空聚焦的线扫描系统的触发信号同步。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：通过采用基于时空聚焦方法的线扫描技术，并提出相应的同步光谱共焦探测技术，可保证高轴向分辨率、低散射信号串扰及高速光谱信息获取，所实现的宽视场层析超光谱显微成像技术适用于深层组织宽视场高速层析显微光谱成像。概括而言，所提出的宽视场层析超光谱显微成像技术可用于深层生物组织的(x,y,z,t,λ)五维信息获取，具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、高光谱分辨率等优点。附图说明图1是本专利技术所述的宽视场层析超光谱显微成像装置的结构示意图。图2是本专利技术的原理示意图。图3是本专利技术装置实施实例1的结构示意图。图4是本专利技术装置实施实例2的结构示意图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做进一步详细的说明。本专利技术提出的一种宽视场层析超光谱显微成像方法，具体包括以下步骤：1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，设定沿激光光谱(即波长)方向为λ轴，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，设定实现沿样品纵向线扫描的振镜偏转角步长，设定实现沿样品轴向扫描的显微物镜轴向步长，根据目标扫描区域的大小设定光谱信息采集周期和扫描总时长；2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线(沿x方向，通过改变振镜的偏转角可实现聚焦线的y方向扫描)；4)通过非线性光学效应在步骤3)的聚焦线上激发出荧光信号，该荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，然后由滤波片滤除反射的超短脉冲激光并由共焦光学狭缝滤除样品散射引起的杂散光，得到样品的条形发射荧光；5)通过色散元件将得到的条形发射荧光进行光谱展开，由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，设定沿激光光谱方向为λ轴，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，设定实现沿样品纵向线扫描的振镜偏转角步长，设定实现沿样品轴向扫描的显微物镜轴向步长，根据目标扫描区域的大小设定光谱信息采集周期和扫描总时长；2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线；4)通过非线性光学效应在步骤3)的聚焦线上激发出荧光信号，该荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，然后由滤波片滤除反射的超短脉冲激光并由共焦光学狭缝滤除样品散射引起的杂散光，得到样品的条形发射荧光；5)通过色散元件将得到的条形发射荧光进行光谱展开，由面阵探测器进行光谱信息采集，得到样品的(x,λ)二维信息；同时，根据设定的振镜偏转角步长改变线扫描的偏转角，获得样品的(x,λ,y)三维信息，直至扫描遍历XY目标区域，完成样品二维平面不同位置光谱信息的获取；其中，所述面阵探测器的探测区域大小完全覆盖所述条形发射荧光的展开程度，且所述面阵探测器与振镜的触发信号同步；6)根据设定的显微物镜轴向步长改变聚焦线的深度，获得样品的(x,λ,y,z)四维信息，直至扫描遍历XYZ目标区域，完成不同深度光谱信息的获取，得到样品内三维空间不同位置的光谱信息；当前扫描周期结束，执行步骤7)；7)根据设定的光谱信息采集周期重复步骤3)～步骤6)进行延时超光谱显微成像，获得样品的(x,λ,y,z,t)五维信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场层析超光谱显微成像。...

【技术特征摘要】
1.一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，设定沿激光光谱方向为λ轴，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，设定实现沿样品纵向线扫描的振镜偏转角步长，设定实现沿样品轴向扫描的显微物镜轴向步长，根据目标扫描区域的大小设定光谱信息采集周期和扫描总时长；2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线；4)通过非线性光学效应在步骤3)的聚焦线上激发出荧光信号，该荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，然后由滤波片滤除反射的超短脉冲激光并由共焦光学狭缝滤除样品散射引起的杂散光，得到样品的条形发射荧光；5)通过色散元件将得到的条形发射荧光进行光谱展开，由面阵探测器进行光谱信息采集，得到样品的(x,λ)二维信息；同时，根据设定的振镜偏转角步长改变线扫描的偏转角，获得样品的(x,λ,y)三维信息，直至扫描遍历XY目标区域，完成样品二维平面不同位置光谱信息的获取；其中，所述面阵探测器的探测区域大小完全覆盖所述条形发射荧光的展开程度，且所述面阵探测器与振镜的触发信号同步；6)根据设定的显微物镜轴向步长改变聚焦线的深度，获得样品的(x,λ,y,z)四维信息，直至扫描遍历XYZ目标区域，完成不同深度光谱信息的获取，得到样品内三维空间不同位置的光谱信息；当前扫描周期结束，执行步骤7)；7)根据设定的光谱信息采集周期重复步骤3)～步骤6)进行延时超光谱显微成像，获得样品的(x,λ,y,z,t)五维信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场层析超光谱显微成像。2.一种根据权利要求1所述基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法的装置，其特征在于，包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、以及滤波与同步光谱共焦探测系统；其中，所述超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整所述激发脉冲光光束尺寸；所述基于时空聚焦的线扫描系统，置于所述光束变换系统之后，包括光学衍射元件、透镜及光学扫描元件，所述光学衍射元...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令杰，谢浩，张元龙，戴琼海，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11