一种怀山药遗传转化的方法技术

本发明专利技术公开了一种怀山药遗传转化的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术的技术方案要点为：以怀山药微型块茎为转化受体，通过农杆菌侵染，将目的基因导入怀山药受体，共培养后转入选择性固体分化培养基中诱导出抗性芽，再转入选择性生根培养基中诱导生根，最终获得怀山药转化植株，通过GUS组织化学染色和PCR的方法对转化植株进行鉴定，最终获得怀山药转基因植株。本发明专利技术的转化过程易操作且周期短，转化效率为2.5%。

【技术实现步骤摘要】
一种怀山药遗传转化的方法
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种怀山药遗传转化的方法。
技术介绍
怀山药（DioscoreaoppositaThunb.）是薯蓣科薯蓣属多年生草质藤本植物，是我国著名的四大怀药之一。怀山药地下块茎药食兼优，但由于其为无性繁殖作物，病毒病的积累造成了严重的品质退化和产量降低[1]。利用常规育种方法改良作物品种周期长、难度大。因此，利用遗传转化手段进行怀山药品种改良具有重要意义。根癌农杆菌的Ti质粒上有一段T-DNA，农杆菌在侵染植物过程中将T-DNA转移到植物细胞并整合到基因组中。农杆菌介导法利用此原理将连接在T-DNA区的目的基因转移并整合到植物基因组中。自然条件下，农杆菌可侵染双子叶植物的受伤部位，因此农杆菌介导法最先应用在双子叶遗传转化研究中[2]。此后，研究者将该法应用于单子叶植物中，最初的研究认为单子叶植物对农杆菌有免疫作用[3]。直到1984年，HernalsteensJP等成功用农杆菌感染单子叶植物石刁柏的愈伤组织[4]。随后农杆菌介导的遗传转化在多种单子叶植物中获得成功，如水稻[5]。目前，利用农杆菌介导法已在多种薯蓣科植物中建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种怀山药遗传转化的方法，其特征在于具体过程为：A.以怀山药微型块茎作为外植体进行转化和再生；B.将所述外植体与农杆菌转入共培养培养基中进行共培养，将携有目的基因的过表达载体pCAMBIA1301‑SERK及沉默载体pART27‑SERK分别导入怀山药受体；C.所述怀山药受体分别直接转入选择性固体分化培养基，诱导抗性芽；D.所述抗性芽分别转入选择性固体生根培养基，诱导生根，获得怀山药转化植株；E.借助GUS、PCR方法鉴别过表达转化植株，借助PCR方法鉴别沉默转化植株，最终获得转基因怀山药植株。

【技术特征摘要】
1.一种怀山药遗传转化的方法，其特征在于具体过程为：A.以怀山药微型块茎作为外植体进行转化和再生；B.将所述外植体与农杆菌转入共培养培养基中进行共培养，将携有目的基因的过表达载体pCAMBIA1301-SERK及沉默载体pART27-SERK分别导入怀山药受体；C.所述怀山药受体分别直接转入选择性固体分化培养基，诱导抗性芽；D.所述抗性芽分别转入选择性固体生根培养基，诱导生根，获得怀山药转化植株；E.借助GUS、PCR方法鉴别过表达转化植株，借助PCR方法鉴别沉默转化植株，最终获得转基因怀山药植株。2.根据权利要求1所述的怀山药遗传转化的方法，其特征在于所述外植体是将怀山药微型块茎切成1-2mm的薄片。3.根据权利要求1所述的怀山药遗传转化的方法，其特征在于所述共培养培养基配方为：MS基本培养基+1mg·L-16-苄基氨基嘌呤+1mg·L-1吲哚乙酸+100μmol·L-1乙酰丁香酮+30g·L-1蔗糖+6g·L-1冷凝脂，pH=6.0；共培养条件为：在28℃条件下暗处培养3d。4.根据权利要求1所述的怀山药遗传转化的方法，其特征在于所述选择性固体分化培养基配方为：MS基本培养基+1mg·L-16-苄基氨基嘌呤+1mg·L-1吲哚乙酸+500mg·L-1特美汀+30g·L-1蔗糖+6g·L-1冷凝脂+15mg·L-1潮霉素/120mg·L-1卡那霉素，pH=6.0；培养条件为：置于光照强度2000-3000lx、光周期16h/d、温度28℃下培养直至抗性芽生长至1-2cm。5.根据权利要求1所述的怀山药遗传转化的方法，其特征在于所述选择性生根培养基配方为：MS基本培养基+2mg·L-1多效唑+0.05mg·L-1萘乙酸+500mg·L-1特美汀+30g·L-1蔗糖+6g·L-1冷凝脂+20mg·L-1潮霉素/160mg·L-1卡那霉素，pH=6.0。6.根据权利要求1所述的怀山药遗传转化的方法，其特征在于具体步骤为：将含有过表达载体pCAMBIA1301-SERK的农杆菌EHA105接种于添加50mg·L-1利福平和50mg·L-1卡那霉素的LB固体培养基上划线，28℃培养30h，挑取单菌落于含相应抗生素的液体LB培养基中，180rmp震荡培养过夜，过夜培养的农杆菌按照体积比1:100的比例转接到新鲜的LB液体培养基中，培养10h后，每1h采用紫外分光光度计检测菌液浓度OD600，选择OD600为0.5的菌液，8000rmp、4℃离心10min，收集菌体沉淀，用MS液体培养基悬浮菌体,重新离心一次，再用含100μm·L-1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬菌体，再次使菌液OD600为0.5，重悬后的菌液重新放入摇床，28℃、180rmp培养30min；在无菌条件下，将怀山药优良品种铁棍山药微型块茎切成1-2mm的薄片，在已处理好的农杆菌菌液中浸没30min，期间每3min摇晃一次，使外植体与菌液充分的接触，时至取出后，用无菌滤纸吸除外植体表面菌液，转入共培养培养基中，该共培养培养基配方为：MS基本培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明军，李俊华，赵喜亭，蒲腾飞，刘世宇，韩林林，宋志辉，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41