裂解性多糖单加氧酶的酶活性制造技术

本发明专利技术处于用于(半)纤维素降解和/或改性的酶的领域，更具体是用于木聚糖的降解和/或改性的酶的领域。本发明专利技术基于一类溶解性多糖单加氧酶(LPMO)的新发现的酶活性，即除了纤维素的氧化裂解之外还具有木聚糖的氧化裂解活性。因此，本发明专利技术涉及一种用于对含木聚糖的底物中的木聚糖进行降解和/或改性的方法，一种用于由含木聚糖的底物制备产物的方法，部件试剂盒，液体、糊剂或固体配制品，以及包含所述LPMO的含木聚糖的组合物。本发明专利技术进一步涉及所述LPMO、所述部件试剂盒、所述配制品和/或所述组合物在本发明专利技术的方法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】裂解性多糖单加氧酶的酶活性
本专利技术处于用于(半)纤维素降解和/或改性的酶的领域，更具体是用于木聚糖的降解和/或改性的酶的领域。本专利技术基于一类溶解性多糖单加氧酶(LPMO)的新发现的酶活性，即除了纤维素的氧化裂解之外还具有木聚糖的氧化裂解活性。因此，本专利技术涉及一种用于对含木聚糖的底物中的木聚糖进行降解和/或改性的方法，一种用于由含木聚糖的底物制备产物的方法，部件试剂盒，液体、糊剂或固体配制品，以及包含所述LPMO的含木聚糖的组合物。本专利技术进一步涉及所述LPMO、所述部件试剂盒、所述配制品和/或所述组合物在本专利技术的方法中的用途。
技术介绍
将植物生物质有效降解为单糖需要各种水解酶和氧化酶，所述单糖是生物化学物质或生物燃料的有用结构单元。这样的酶优选地是耐热的，因为植物细胞壁的硬度需要热辅助性预处理作为增加细胞壁多糖的可及性的第一步(1)。用于植物细胞壁降解的商业酶混合物主要包括由丝状真菌如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)和踝节菌属(Talaromyces)菌株产生的酶。另外，可商购的真菌嗜热毁丝霉C1是用于生产耐热碳水化合物活性酶的良好候选物(2)。还有，酶驱动的生物炼制工艺的成功需要改进现有的酶混合物。次级植物细胞壁由与半纤维素相互作用的纤维素原纤维的基质构成，并与酚木质素的网络胶合在一起(3-5)。大多数半纤维素由木聚糖、甘露聚糖和木糖-葡聚糖结构单元构成，这些结构单元分别具有β-(1→4)连接的木糖基残基、β-(1→4)连接的甘露糖基或β-(1→4)连接的葡萄糖基残基的骨架(6)。这种半纤维素经由氢键与纤维素，特别是与具有低取代基量或取代基的嵌段分布的那些纤维素强烈地缔合(3,5)。纤维素缔合半纤维素阻断纤维素酶到达它们的靶底物，这可能有助于植物对微生物侵袭的防御。此外，半纤维素通过商业酶(7,8)在可发酵单糖的形成中抑制植物多糖的解构。因此，这些纤维素缔合半纤维素的降解对于改善植物生物质的纤维素水解是必不可少的。由于木聚糖是半纤维素的主要成分，因此降解木聚糖的酶在半纤维素降解中起主要作用。木聚糖降解和/或改性酶广泛应用于工业中，如动物饲料的升级、提高烘焙和酿造产品的质量、漂白和改性软和硬木牛皮纸浆、纸张回收、浸渍蔬菜和水果、净化谷物溶液和果汁、以及从农业和林业产生的残留物生产生物燃料和/或其他化学品。然而，在许多实际应用中，木聚糖降解和/或改性的酶的使用不是直接的；这些酶在使用它们的过程的温度和pH条件下必须是有活性的。例如，使用造粒、挤出或膨胀的商业饲料的配制通常包含涉及高温(70℃-180℃)的步骤，并且需要能经受这些条件的酶。此外，漂白过程，以及甚至是漂白过程中使用的步骤的顺序在不同的纸浆厂中是不同的，并且因此提供了对在这些方法中使用的酶的特定要求。由于植物木聚糖的异质性和复杂的化学性质以及应用的广泛和异源性质，因此对发现新的木聚糖降解和/或改性酶活性，优选在不同的温度和pH条件下的活性存在不断需求。因此，本专利技术的目的是提供用于改性和/或降解木聚糖的新装置和方法。本专利技术提供了新发现的一类真菌酶，即耐热溶解性多糖单加氧酶(LPMO)的酶活性。本专利技术的LPMO是先前称为GH61酶的辅助活性家族9(AA9)LPMO。这些酶被描述为具有纤维素分解活性和纤维素分解增强活性(Morgenstern等人，2014，Fungalcellulosedegradationbyoxidativeenzymes:fromdysfunctionalGH61familytopowerfullyticpolysaccharidemonooxygenasefamily[通过氧化酶进行的真菌纤维素降解：从功能失调的GH61家族到强大的溶解性多糖单加氧酶家族]，BriefingsinFunctionalGenomics[功能基因组学简报]，13(6):421-423)。专利技术人发现在氧化的木糖和葡糖低聚物形成时，本专利技术的LPMO不仅切割纤维素还切割木聚糖，例如，在纤维素缔合木聚糖中。此外，当与内切葡聚糖酶一起作用时，LPMO显示出协同效应。本专利技术进一步提供了在需要切割纤维素和/或木聚糖的各种应用中使用该新颖LPMO的方法。
技术实现思路
定义如本文所用，术语“木质素”、“lignen”、“糖化”、“可发酵糖”、“生物质”、“木质纤维素材料”、“农业生物质”、“能量作物”、“纤维素”和“半纤维素”在本文中被理解为如WO2013/159005A2中所定义的。如本文所用，“氧化还原酶”、“氧化酶”、“单加氧酶”、“羟化酶”、“脱氢酶”、“纤维二糖脱氢酶”、“纤维二糖脱氢酶”、“纤维二糖氧化酶”、“糖酶”、“糖苷水解酶”、“糖基水解酶”、“糖苷酶”、“内切葡聚糖酶”、“纤维二糖水解酶”和“半纤维素酶”、“木聚糖酶”、“β-甘露聚糖酶”、“内切-1,4-β-甘露糖苷酶”、“甘露聚糖内切-1,6-α-甘露糖苷酶”、“β-甘露糖苷酶”、“半乳聚糖酶”、“内切-β-1,6-半乳聚糖酶”、“阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶”“葡糖淀粉酶”、“β-己糖胺酶”、“β-N-乙酰葡糖胺酶”、“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”、“α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶”、“α-阿拉伯呋喃糖苷酶”、“阿拉伯糖苷酶”、“阿拉伯呋喃糖苷酶”、“内切阿拉伯糖酶”、“外切阿拉伯糖酶”、“β-木糖苷酶”、“壳聚糖酶”、“外切多聚半乳糖醛酸酶”、“乙酰木聚糖酯酶”、“乙酰甘露聚糖酯酶”、“阿魏酯酶”、“阿魏酸酯酶”、“香豆酸酯酶”、“果胶酸裂解酶”、“果胶裂解酶”、“内切-1,3-β-葡聚糖酶”、“昆布多糖酶”、“地衣酶”、“糖苷酶”和“木质酶”在本文中将被理解为如在WO2013/159005A2中所定义的。如本文所用，提及“酶”包括全长天然存在的或野生型酶或蛋白质(术语酶和蛋白质在本文中可互换使用)及其糖基化的形式或其他修饰形式、融合蛋白或任何片段或同源物，或这类酶或蛋白质的变体。优选地，酶是分离的酶或蛋白质。分离的酶或蛋白质在本文中将被理解为已经从其天然环境中去除(即，已经经过人类操作)的酶或蛋白质(包括多肽或肽)，并且可以包括例如纯化的蛋白质、部分纯化的蛋白质、重组产生的蛋白质、合成产生的蛋白质、与脂质络合的蛋白质、可溶性蛋白质以及与其他蛋白质相关的分离的蛋白质。就此而言，“分离的”不反映蛋白质被纯化的程度。优选地，分离的蛋白质是重组产生的。另外，并且举例来说，“嗜热毁丝霉蛋白质”或“嗜热毁丝霉酶”是指来自嗜热毁丝霉的蛋白质(通常包括天然存在的蛋白质的同源物或变体)或另外已经从结构(例如，序列)知识产生的蛋白质，并且优选地是来自嗜热毁丝霉的天然存在的蛋白质的功能。换句话说，嗜热毁丝霉蛋白质包括与天然存在的嗜热毁丝霉蛋白质具有基本上相似的结构和功能的任何蛋白质，或者是如本文详细描述的来自嗜热毁丝霉的天然存在的蛋白质的生物活性(即具有生物学活性)同源物或变体。因此，嗜热毁丝霉蛋白质可以包括纯化的、部分纯化的、重组的、突变的/修饰的以及合成的蛋白质。如本文所用，短语蛋白质的“生物活性”是指由蛋白质表现或执行的任何一种或多种功能，该蛋白质属于如在体外或体内测量或观察到的天然存在形式的蛋白质。蛋白质片段优选地包含蛋白质的结构域，该结构域具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于对含木聚糖的底物中的木聚糖进行降解和/或改性的方法，其中所述方法包括将该含木聚糖的底物与家族AA9的溶解性多糖单加氧酶(LPMO)进行接触的步骤，其中所述LPMO是嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila，Mt)LPMO9A或其具有木聚糖氧化活性的同源物、变体或片段，并且其中所述含木聚糖的底物进一步包含电子供体和纤维素或进一步与电子供体和纤维素接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.11 EP 15158572.61.一种用于对含木聚糖的底物中的木聚糖进行降解和/或改性的方法，其中所述方法包括将该含木聚糖的底物与家族AA9的溶解性多糖单加氧酶(LPMO)进行接触的步骤，其中所述LPMO是嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila，Mt)LPMO9A或其具有木聚糖氧化活性的同源物、变体或片段，并且其中所述含木聚糖的底物进一步包含电子供体和纤维素或进一步与电子供体和纤维素接触。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述LPMO是包含与SEQIDNO:1至少80％同一的氨基酸序列或由其组成的酶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述LPMO是具有由SEQIDNO:1表示的氨基酸序列的MtLPMO9A。4.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括葡聚糖降解和/或改性。5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述含木聚糖的底物包含一种或多种另外的酶或进一步与一种或多种另外的酶进行接触，其中优选地所述另外的酶中的至少一种是糖基水解酶，优选内切葡聚糖酶。6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括纤维素的和/或与半纤维素缔合的纤维素的降解和/或改性。7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述含木聚糖的底物包含面粉或由其组成。8.一种用于制备烘焙组合物的方法，其中所述方法包括将含木聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·克齐尔，J·维瑟，S·W·A·欣茨，M·A·卡贝尔，M·弗洛姆黑根，H·格鲁鹏，
申请(专利权)人：杰能科国际有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL