基于N-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法技术

本发明专利技术属于人体氨基代谢物测量技术领域，具体为基于N‑乙基化衍生方法的多种氨基代谢物同步定量分析方法。本发明专利技术步骤包括：氨基代谢物及生物样品的衍生化反应；采用UHPLC‑MS/MS（超高效液相色谱‑质谱联用）对氨基类代谢物的定量检测分析；氨基代谢物的检测与方法学验证；生物样品的普适性验证。本发明专利技术采用氨基乙基化的方法，改善了氨基代谢物柱上保留并提高了其质谱离子化效率，使用NaBH3CN/NaBD3CN作为一对稳定同位素标记试剂对分析物进行处理，可实现更为精准的同位素内标定量测量。本发明专利技术反应条件温和、操作简便、反应原料易于淬灭、且具有较高检测灵敏度及精密度，适合于多种氨基代谢物同步定量分析。

【技术实现步骤摘要】
基于N-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法
本专利技术属于人体氨基代谢物测量
，具体涉及基于N-乙基化衍生方法的多种氨基代谢物同步定量分析方法。
技术介绍
氨基类代谢物指分子中含有氨基的一类代谢物的总称。氨基代谢物除了我们所熟知的氨基酸，还包括有一些其他含氮物质(如嘌呤、嘧啶等)及一些胺类物质(如组胺、色胺、腐胺、亚精胺等)，它们参与生物体多条代谢途径并起着关键性作用。由此可见，氨基代谢物的种类及含量变化与生物体的生理及生理病理过程密切相关，高效高灵敏地定量分析这类代谢物对于疾病的诊疗、药物设计与药代动力学分析等方面具有重大意义。由于生物基质的复杂性以及氨基代谢物较多的种类和较大的浓度动态范围，目前基于UHPLC-MS的氨基代谢物定量分析存在以下难点：第一，这类代谢物大多极性强，不适合直接用于反相柱的分离，而亲水柱色谱在峰重现性、峰形及分辨率方面较反相柱存在劣势；第二，这类代谢物离子化效率低，质谱响应弱；第三，由于基质效应的影响在相同检测条件下质谱的响应会存在波动，同位素内标虽然可解决外标定量不准确的问题，但价格昂贵且很难制备或购买。因此，如何建立合适的可覆盖多种氨基代谢物的衍生化方案，并具备如下特征：反应条件温和；反应特异性强，无其他物质干扰或可消除干扰；探针具备多种同位素标记物，可以通过色谱质谱的技术实现准确内标定量的同时更可以增加检测通量是目前需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种反应条件温和、特异性强、反应原料易于淬灭的多种氨基代谢物同步定量分析方法。本专利技术提供的多种氨基代谢物同步定量分析方法，是基于氨基代谢物的N-乙基化柱前衍生方法(简称“N-乙基化法”)的，然后通过UHPLC-MS/MS同时对多种(80种)人体氨基代谢物进行高灵敏的内标定量分析。本专利技术方法操作性强且检测灵敏度高。本专利技术提供的基于N-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法，具体步骤如下：(1)氨基代谢物溶液的配制：取80种氨基代谢物，用含有一定甲酸的乙腈水溶液配制成10-600μM的标准混合溶液；80种氨基代谢物标准混合溶液具体见表1所示；(2)氨基代谢物的衍生化反应：取混合氨基代谢物溶液，用pH为5-7的醋酸钠缓冲溶液稀释，分别加入NaBH3CN或NaBD3CN(内标)，涡旋混匀后加入乙醛水溶液，25-37℃反应过夜。反应液中，氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比大于1:9:18，例如为1:(9—12):(18—24)；然后用甲酸调节反应液pH至2-3，淬灭反应；衍生化反应完成后过滤，得到衍生化产物；(3)生物样本预处理：生物样本为尿液、血清、唾液；对于尿液样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液。对于血清样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液。对于唾液样本，离心，收集上清液；取上清液，加入甲醇，涡旋混匀，再次离心，并收集此次上清液；(4)生物样本的衍生化反应：取预处理后的生物样本，用pH为5-7的醋酸钠缓冲溶液稀释，加入NaBH3CN，涡旋混匀，加入乙醛水溶液，25-37℃反应过夜，然后用甲酸调节反应液pH至2-3，淬灭反应；反应液中，氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比大于1:9:18，例如为1:(9—12):(18—24)。反应液经滤膜过滤，与稀释20-100倍后的重标标准品按一定的体积比混合；进入UHPLC-MS测样前于-80℃密封保存；(5)氨基代谢物标准品的检测：将上述反应后的溶液直接进入UHPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)进行测定；(6)方法验证：建立80种氨基代谢物的标准曲线，并求得线性范围、R2(相关系数)、LOQ(定量限)、LOD(检测限)以及日间差和日内差；以对所建方法的检测灵敏度及精密度进行评估；(7)普适性验证：反应后的生物样本过滤后进入UHPLC-MS进行测定。进一步地，步骤(1)中甲酸的乙腈水溶液里甲酸的含量优先为0.5％，乙腈的含量为30％。进一步地，步骤(2)中的衍生化反应采用化学同位素标记法：采用一对稳定同位素标记试剂NaBH3CN和NaBD3CN分别对分析物进行衍生化处理，得到重标与轻标产物，用于内标定量研究。进一步地，步骤(2)和步骤(4)中，衍生化反应在37℃下进行；反应溶剂为pH为5的醋酸钠缓冲液，氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比优先为：1:10:20。进一步地，步骤(3)所述的生物样本中，尿液样本取自健康志愿者晨尿，血清样本取自健康志愿者，唾液样本取自健康志愿者。进一步地，步骤(4)中所述对重标溶液优先选择稀释100倍；反应液与稀释后的重标标准品比例优先选择为1:1。进一步地，所述步骤(5)和步骤(7)中的UHPLC-MS测定过程工作条件为：a、色谱条件：使用Agilent1290UHPLC系统，采用ACQUITYUPLCHSST3反相色谱柱。流动相A配置为含有0.05-0.1％甲酸的双蒸水，流动相B为含有0.05-0.1％甲酸的乙腈溶液。流速设为0.400-0.600mL/min，进样量设为0.20-5.00μL，柱温设为35-45℃；b、质谱条件：使用Agilent6495QqQMS系统，采用ESI离子源，干燥气温度：150-290℃，干燥器流量：10-20L/min，雾化器压力：40-60psi，鞘气温度：250-400℃，鞘气流量：5-12L/min，毛细管电压：3500-4000V，喷嘴电压：400-600V。数据采集使用正离子、MRM模式，采样前0.5min进废液瓶。进一步地，所述步骤(5)和步骤(7)中UHPLC-MS测定操作中：优先选择为:流动相A配置为含有0.1％甲酸的双蒸水，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液。洗脱梯度以流动相B百分比表示为：0.00-2.00min，1.00％；2.00-4.00min，1.00-3.80％；4.00-8.00min，3.80-22.00％；8.00-8.50min，22.00％；8.50-9.50min，22.00-60.00％；9.50-10.50min：60.00％；10.50-11.00min，60.00-80.00％；11.00-11.10，80.00-95.00％；95％到13.00min。流速设为0.500mL/min，进样量设为1.00μL，柱温设为40℃；优先选择为：采用ESI离子源，干燥气温度：250℃，干燥器流量：12L/min，雾化器压力：50psi，鞘气温度：350℃，鞘气流量：12L/min，毛细管电压：4000V，喷嘴电压：500V。数据采集使用正离子、MRM模式，采样前0.5min进废液瓶。进一步地，步骤(6)所述检测方法的验证具体为：a、标准曲线的建立：采用同位素内标定量，轻标稀释5倍后按1:2:2.5:2:2:5:2:5:2的比例逐级稀释成9个浓度梯度，重标稀释100倍；将9个浓度梯度的轻标与重标等体积混合后进入UHPLC-MS/MS检测分析(浓度从高到低依次表示为mix1、mix2、mix3、mix4、mix5、mix6、mix7、mix8、mix9)。以轻标与重标的峰面积之比作为纵坐标，以轻标浓度作为横坐标，每个浓度比例做三个平行，每个样重复进样两次，得到标准曲线、R2以及线性范围；b、检测限(LOD)及定量限本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于N‑乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）氨基代谢物溶液的配制：取80种氨基代谢物，用含有一定甲酸的乙腈水溶液配制成20‑600μM的标准混合溶液；（2）氨基代谢物的衍生化反应：取混合氨基代谢物溶液，用醋酸钠配制成pH为5‑7的反应缓冲液，分别加入NaBH3CN或NaBD3CN（内标），涡旋混匀后加入乙醛水溶液，25‑37℃反应过夜；反应液中，氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比大于1:9:18；然后用甲酸调节反应液pH至2‑3，淬灭反应；衍生化反应完成后过滤，得到衍生化产物；（3）生物样本预处理：生物样本为尿液、血清、唾液；对于尿液样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液；对于血清样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液；对于唾液样本，离心，收集上清液；取上清液，加入甲醇，涡旋混匀，再次离心，并收集此次上清液；（4）生物样本的衍生化反应：取预处理后的生物样本，用醋酸钠配制成pH为5‑7的反应缓冲液稀释，加入NaBH3CN，涡旋混匀，加入乙醛水溶液，25‑37℃反应过夜，然后用甲酸调节反应液pH至2‑3，淬灭反应；反应液经滤膜过滤，与稀释20‑100倍后的重标标准品按一固定的体积比混合；（5）氨基代谢物标准品的检测：将上述反应后的溶液直接进入UHPLC‑MS进行测定；（6）方法验证：建立80种氨基代谢物的标准曲线，并求得线性范围、R2、LOQ、LOD以及日间差和日内差，以对所建方法的检测灵敏度及精密度进行评估；（7）普适性验证：反应后的生物样本过滤后进入UHPLC‑MS（超高效液相色谱‑质谱联用）进行测定。...

【技术特征摘要】
1.一种基于N-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）氨基代谢物溶液的配制：取80种氨基代谢物，用含有一定甲酸的乙腈水溶液配制成20-600μM的标准混合溶液；（2）氨基代谢物的衍生化反应：取混合氨基代谢物溶液，用醋酸钠配制成pH为5-7的反应缓冲液，分别加入NaBH3CN或NaBD3CN（内标），涡旋混匀后加入乙醛水溶液，25-37℃反应过夜；反应液中，氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比大于1:9:18；然后用甲酸调节反应液pH至2-3，淬灭反应；衍生化反应完成后过滤，得到衍生化产物；（3）生物样本预处理：生物样本为尿液、血清、唾液；对于尿液样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液；对于血清样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液；对于唾液样本，离心，收集上清液；取上清液，加入甲醇，涡旋混匀，再次离心，并收集此次上清液；（4）生物样本的衍生化反应：取预处理后的生物样本，用醋酸钠配制成pH为5-7的反应缓冲液稀释，加入NaBH3CN，涡旋混匀，加入乙醛水溶液，25-37℃反应过夜，然后用甲酸调节反应液pH至2-3，淬灭反应；反应液经滤膜过滤，与稀释20-100倍后的重标标准品按一固定的体积比混合；（5）氨基代谢物标准品的检测：将上述反应后的溶液直接进入UHPLC-MS进行测定；（6）方法验证：建立80种氨基代谢物的标准曲线，并求得线性范围、R2、LOQ、LOD以及日间差和日内差，以对所建方法的检测灵敏度及精密度进行评估；（7）普适性验证：反应后的生物样本过滤后进入UHPLC-MS（超高效液相色谱-质谱联用）进行测定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的衍生化反应采用化学同位素标记法：采用一对稳定同位素标记试剂NaBH3CN/NaBD3CN分别对分析物进行衍生化处理，得到重标与轻标产物，用于内标定量研究。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐惠儒，薛海斯，彭叶青，李鹏程，蔡润娴，殷红，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31