本发明专利技术涉及一种个体粪便样本中菌群平衡关系指标的计算方法，及其在结直肠癌(CRC)中的筛查、诊断或辅助诊断中的应用。通过提取粪便中细菌的DNA测序获得细菌种类和数量的特征，并以多种细菌的数量比值特征为基础进行CRC的诊断。与目前已用于临床或申请专利的无创性筛选CRC的方法相比，本发明专利技术完全无创，而且能更准确的诊断CRC。分析结果显示，具核梭杆菌Fn与双歧杆菌Bb数量的比值(Fn/Bb)对于筛查出CRC具有较高的敏感度和特异性，分别达到84.6％和92.3％(AUC＝0.911)。进一步联合具核梭杆菌Fn与柔嫩梭菌Fp数量的比值(Fn/Fp)提高了对CRC的诊断价值，其受试者工作特征曲线的曲线下面积(Area Under Curve，AUC)达到了0.943。此外，Fn/Bb和Fn/Fp数量比值的联合筛查I期CRC具有60％的特异性和90％的敏感性。
An evaluation method of bacterial population stability in stool samples and its application in colorectal cancer screening
The invention relates to a method for calculating bacterial balance index in individual stool samples and its application in screening, diagnosis or auxiliary diagnosis of colorectal cancer (CRC). The characteristics of bacterial species and quantity were obtained by DNA sequencing of bacteria in feces, and CRC diagnosis was carried out based on the quantitative ratio characteristics of many bacteria. Compared with the current non-invasive screening method for clinical or patent applications, the present invention is completely non-invasive and can diagnose CRC more accurately. The results showed that the ratio of Fn/Bb of Fusobacterium nucleatum to Bb of Bifidobacterium bifidum had high sensitivity and specificity for screening CRC, reaching 84.6% and 92.3% respectively (AUC = 0.911). Further, the Fn/Fp ratio of Fusobacterium nucleatum Fn to Clostridium tenella increased the diagnostic value of CRC, and the area under the curve (AUC) of the subjects'working characteristic curve reached 0.943. In addition, the combination of Fn/Bb and Fn/Fp was 60% specific and 90% sensitive for stage I CRC screening.
【技术实现步骤摘要】
一种粪便样本中菌群稳态评价方法及在结直肠癌筛查中的应用
本专利技术涉及结肠直肠癌(Colorectalcancer，CRC)体外诊断领域，本专利技术提供了一种指示个体粪便样本中菌群平衡关系的指标菌组合及其计算方法，用于无创性诊断和筛查结直肠癌
技术介绍
结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，根据WHO报道，结直肠癌是男性第三位和女性第二位常见的恶性肿瘤。近年来在我国的发病率和死亡率不断攀升，每年新增病例已超过17万人，死亡近10万人，发病率位居我国恶性肿瘤第三。早期结直肠癌不易发现，绝大多数患者在出现便血、腹痛等症状三个月到半年后才到医院就诊。届时癌细胞已扩散甚至向远处转移，失去了最佳的手术治疗时机。近年尽管诊疗技术不断发展，但由于缺乏有效的早期筛查方法，患者术后5年生存率并无明显改善。目前，粪便隐血试验(FOBT)是结直肠癌无创普查的主要途径，进而筛选出高危人群进行肠镜检查。然而FOBT缺乏特异性，初筛顺应性及高危人群的肠镜受检率仅30％-40％，疾病检出率约19％左右，有待进一步提高。利用无创的标志物对人群进行筛查，可缩小肠镜检查人数且进一步提高肠镜的特异性及灵敏度，对于早期诊断结直肠癌具有重要的临床意义。具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，Fn)是重要的结直肠癌致病的相关细菌，与结直肠癌的两种癌前病变：炎性肠病(IBD)及结肠腺瘤密切相关，该菌在肠道中数量的变迁可以预测肿瘤由良性向恶性转化的发展趋势；粪便或肠道组织中Fn菌的数量增多可以作为肿瘤微生物标志物对结直肠癌患者进行诊断。益生菌对肠道稳态起重要作用。健康个体肠道的益生菌和条件致病菌保持数量平衡。但当机体内环境变化时，菌群平衡失控。柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii，Fp)菌和双歧杆菌(Bifidobactcrium，Bb)为人类肠道中最重要的益生菌。结直肠癌患者与健康人群相比，表现出明显的以益生菌数量减少为特征的肠道菌群稳态失衡现象。我们的研究证实了致癌细菌Fn对Fp，Bb等益生菌具有较强的拮抗作用，且结直肠癌患者体内Fn与Fp菌数量呈负相关。基于以上发现，我们选用这三个种属的细菌(Fn、Fp、Bb菌)作为指标菌组合，计算肿瘤致病细菌与益生菌的数量比值并进行综合分析，结果显示Fn/Bb和Fn/Fp比值联合具有良好的诊断结直肠癌(AUC＝0.943)和良性腺瘤(AUC＝0.916)的能力，尤其对区分早期结肠癌(I-II期)与良性腺瘤，诊断能力达AUC＝0.849。表明Fn/Bb+Fn/Fp联合诊断可作为结直肠癌早期诊断的一种非侵入性指标。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供人粪便样本中指示肠道菌群稳态的标志物性微生物组合及菌群稳态计算方法，并应用于结直肠癌的早期筛查和辅助诊断。本专利技术采取的技术方案是：①确定Fn、Fp、Bb菌为肠道菌群稳态的微生物指标菌；②根据细菌的16SrDNA基因序列设计三个菌属的特异性引物或其互补rRNA序列特异杂交的核酸探针；③提取细菌基因组DNA，应用实时荧光定量PCR反应测定三个菌群的数量；④根据样本中上述三个菌群的绝对含量，计算Fn/Fp值和Fn/Bb比值；⑤联合Fn/Fp+Fn/Bb，根据ROC曲线，设定诊断的cutoff值，预测样本提供者肠道菌群是否失衡及患结直肠癌的可能性。本专利技术的有益效果是：1、提供简单的仅有三种菌的微生物指标组合，成本低廉，具有良好的肠道健康筛查和临床辅助诊断推广价值；2、提供简单的比值计算方法，可以高灵敏度和高特异性诊断结直肠癌。3、本方法还可以区分癌前病变与早期结直肠癌；用于早期结直肠癌诊断及筛查。附图说明图1为结直肠癌患者与对照组人群粪便微生物标志物丰度检测。图2为微生物标志物对结直肠癌的诊断价值。图3为微生物标志物对结直肠癌的早期诊断价值。图4为微生物标志物区分早期结直肠癌(I+II期)和良性结直肠肿瘤(BCD)。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐明本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实验中所使用的微生物指标菌为：具核梭杆菌(F.nucleatum，Fn)、柔嫩梭菌(F.prausnitzii，Fp)菌、双歧杆菌(Bifidobacterium，Bb)。下述实验中所使用的微生物标志物为细菌定量比值Fn/Bb，Fn/Fp，联合比值Fn/Bb+Fn/Fp。下述实验中所使用对照人群为三组：非胃肠道肿瘤组(Non-gastrointestinalcancer，NGC)，良性结直肠疾病组(Benigncolondisease，BCD)，健康人(Healthysubjects，HS)组。数据分析：计数结果应用统计软件SPSS16.0进行分析，独立t检验或Wilcoxont检验和Mann-WhitneyU检验；通过受试者工作特征曲线(receiveroperatorcharacteristiccurve，ROC)判断微生物标志物在结直肠癌诊断中的灵敏度和特异度，通过多元logistic回归分析寻找最佳组合。P＜0.05为差异有统计学意义实施案例1：粪便样本总DNA提取1、样本收集：本研究所采集的粪便标本包含215例CRC，100例NGC，156例HS。178例BCD。215例CRC患者中早期患者97名：I期CRC38例，II期CRC59例。在收集每一例患者的标本及背景信息前均与患者签订知情同意书从而获得使用其信息作为研究许可。215例CRC患者平均年龄为61.2岁，年龄范围22-93岁，其中男性118例，女性97例；178例BCD患者平均年龄54.2岁，年龄范围31-81岁，其中男性86例，女性92例；100名NGC患者平均年龄为58.4岁，年龄范围34-73岁，其中男性48例，女性52例；156例HS平均年龄为48.6岁，年龄范围20-78岁，其中男性70例，女性86例。标本与病例筛选标准为：①所有癌症患者均经过组织病理学检测；②所有的粪便标本均采集自确诊后手术前时期；③患者在过去三个月内未使用过抗生素药物。样品用干净的标本收集杯收集后立即冻存于-80℃。本研究中所使用CRC患者均通过活检组织学确诊其罹患CRC，按照美国癌症联合会AJCC第7版标准进行TNM分期。BCD患者的诊断是根据标准的内窥镜，组织学和X光射线检查确诊的。2、粪便样本菌群总DNA的提取：按总基因组抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，DP328)常规操作提取粪便总基因组DNA，将提取的核酸用紫外分管光度计(NanoDrop2000，ThermoFisherScientific)测定其浓度。实施案例2：微生物指标菌细菌定量分析1、标准品的制作：以Fn标准菌株ATCC25586，Fp标准菌株ATCC27766，Bb标准菌株BB-12的细菌DNA为标准品，进行常规PCR反应。PCR反应体系25μL：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMixture1μL，5μmol/L上下游引物各2μL，DNA模板2μL，DNATaq酶(5U/μL)0.2·L，H2O15.3μL。扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种粪便样本中肠道菌群稳态评价方法及在结直肠癌筛查中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种粪便样本中肠道菌群稳态评价方法及在结直肠癌筛查中的应用。2.根据权利要求1所述的肠道菌群稳态评价方法，其特征在于，所述检测指标菌为具核梭杆菌(F.nucleatum，Fn)；双歧杆菌属(Bifidobacterium，Bb)和柔嫩梭菌(F.prausnitzii，Fp)共三个种属的细菌组合。3.根据权利要求1所述的肠道菌群稳态评价方法，其特征在于，计算具核梭杆菌与双歧杆菌属的细菌数量比值(Fn/Bb)作为诊断标志物。4.根据权利要求1所述的肠道菌群稳态评价方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张革，郭松鹤，陆永帆，刘万里，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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