一种牛冻精稀释液及其制备方法技术

本发明专利技术属于牛冻精生产技术领域，具体涉及一种牛冻精稀释液及其制备方法,每100ml稀释液中包含以下组分：终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，终浓度为5mMol/ml～15mMol/ml的肉碱，终浓度为15％卵黄，终浓度为5％的甘油，终浓度为10％的青霉素，终浓度为10％的链霉素，终浓度为0.01％—1％的透明质酸水溶液，余量为灭菌蒸馏水；将透明质酸加入冻精液中可以有效避免精子在保存期的能量消耗，并改善牛冻精液的质量。实验表明，通过应用本发明专利技术所述的牛冻精稀释液稀释冷冻保存的牛精液，解冻后精子活力≥38％。

A kind of Bovine Frozen semen dilution solution and its preparation method

The invention belongs to the technical field of Bovine Frozen Semen production, in particular relates to a bovine frozen semen dilution and a preparation method thereof. Each 100 ml dilution contains the following components: Tris with a final concentration of 0.024 g/ml, citric acid with a final concentration of 0.013 g/ml, glucose with a final concentration of 0.01 g/ml, carnitine with a final concentration of 5 mMol/ml to 15 mMol/ml, and carnitine with a final concentration of 15 mMol/ml. Egg yolk, 5% glycerol, 10% penicillin, 10% streptomycin, 0.01%-1% hyaluronic acid aqueous solution and sterilized distilled water are the final concentration. Adding hyaluronic acid into frozen semen can effectively avoid the energy consumption of sperm during storage and improve the quality of frozen bovine semen. Quantity. Experiments show that the sperm viability of frozen bovine semen is more than 38% after thawing by diluting frozen bovine semen with the bovine frozen semen dilution.

【技术实现步骤摘要】
一种牛冻精稀释液及其制备方法
本专利技术属于牛冻精生产
，具体涉及一种牛冻精稀释液及其制备方法。
技术介绍
我国自上世纪七十年代开展牛冷冻精液生产，迄今已有四十年历史。大型牛场同期处理后，每一位输精员要负责上千头母牛输精，都会选择将冻精一次性解冻，从第一头到最后一头需要3-5个小时，精子在解冻后的存活时间十分重要。精子在解冻后的存活时间与精子自身的能量高低和解冻后的活力密切相关，精子自身能量的高低与种牛的体质相关，而精子解冻后的活力受稀释液内成分的影响较大，目前市面上的冻精稀释液普遍存在精子存活时间短的问题。透明质酸是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子(Naturalmoisturizingfactor，NMF)例如：2％的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98％水分。透明质酸是一种大分子难溶的物质，透明质酸水溶液是一种非牛顿型流体，有着良好的粘弹性和流变形。由于透明质酸具有良好的保水性、粘弹性和流变性，本申请的专利技术人尝试将其加入冻精稀释液中，以期解决精子在解冻后存活时间短的问题。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的不足之处，本专利技术的目的就在于提供一种牛冻精稀释液及其制备方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：一种牛冻精稀释液，每100ml稀释液中包含以下组分：终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，终浓度为5mMol/ml～15mMol/ml的肉碱，终浓度为15％(体积百分数，下同)卵黄，终浓度为5％的甘油，终浓度为10％的青霉素，终浓度为10％的链霉素，终浓度为0.01％—1％的透明质酸水溶液，余量为灭菌蒸馏水。上述牛冻精稀释液的制备方法，包括如下步骤(以1000ml稀释液为例)：步骤(1)：配置0.01％—1％透明质酸水溶液将800ml量的灭菌水置于锥形瓶中，将终浓度为0.01％—1％的透明质酸加入灭菌水中，将锥形瓶置于水浴中加热溶解；步骤(2)：向步骤(1)水浴溶解后的透明质酸水溶液中加入终浓度为5mMol/ml-15mMol/ml的肉碱，并搅拌均匀；步骤(3)：向步骤(3)所得的溶液中加入终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，摇匀后，1000ml定容，在4℃保存，待用；步骤(4)：在使用稀释液前半小时，向步骤(3)所制得的溶液中加入终浓度为5％的霉素及终浓度为5％的链霉素，搅匀后，得到牛冻精稀释液。优选地，上述牛冻精稀释液的制备方法，步骤(1)中所述的水浴溶解的水浴温度为37℃，水浴时间为2小时。与现有技术相比较，本专利技术所述的牛冻精稀释液及其制备方法，具有如下创新点：(1)首次将透明质酸作为精子活力抑制剂成功应用于牛精液冷冻保存：本专利技术针对目前牛冻精稀释液常存在解冻后牛精子活力不足的问题，将透明质酸应用于牛精液的冷冻保存研究中。将透明质酸加入牛冻精稀释液中，在使用时透明质酸包覆在精子周围，在精子周围形成膜结构，而且透明质酸具有良好的粘弹性和流变性，使整个精子的活动能力降低，使精子内蕴含的能量不受消耗，一旦精子进入输卵管，精子表面包覆的透明质酸被输卵管内的环境液降解后，精子恢复其原有的运动状态，精子内蕴含的能量被重新释放，将透明质酸加入冻精液中可以有效避免精子在保存期的能量消耗，并改善牛冻精液的质量。实验表明，通过应用本专利技术所述的牛冻精稀释液稀释冷冻保存的牛精液，解冻后精子活力≥38％。(2)本专利技术中使用的透明质酸来源广、成本低廉、纯度高、化学稳定性好，制成的冻精稀释液安全可靠，成本低廉。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1一种牛冻精稀释液，每100ml稀释液中包含以下组分：终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，终浓度为5mMol/ml～15mMol/ml的肉碱，终浓度为15％卵黄，终浓度为5％的甘油，终浓度为10％的青霉素，终浓度为10％的链霉素，终浓度为0.01％—1％的透明质酸水溶液，余量为灭菌蒸馏水。上述牛冻精稀释液的制备方法，包括如下步骤：步骤(1)：配置0.01％—1％透明质酸水溶液将800ml量的灭菌水置于锥形瓶中，将终浓度为0.01％—1％的透明质酸加入灭菌水中，将锥形瓶置于水浴中加热溶解；步骤(2)：向步骤(1)水浴溶解后的透明质酸水溶液中加入终浓度为5mMol/ml-15mMol/ml的肉碱，并搅拌均匀；步骤(3)：向步骤(3)所得的溶液中加入终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，摇匀后，1000ml定容，在4℃保存，待用；步骤(4)：在使用稀释液前半小时，向步骤(3)所制得的溶液中加入终浓度为5％的霉素及终浓度为5％的链霉素，搅匀后，得到牛冻精稀释液。制得的牛冻精稀释液置于37℃水浴锅中保温直至鲜精加完稀释液。具体地，上述牛冻精稀释液的制备方法，步骤(1)中所述的水浴溶解的水浴温度为37℃，水浴时间为2小时。实施例1的步骤(1)中，透明质酸不易溶解，搅拌溶解的方法会使大分子物质低分子化，破坏其分子结构，影响透明质酸的使用效果。本专利技术采用加热溶解的方法对其进行溶解，在加热溶解的过程中，不对溶解液搅拌，有效的解决了透明质酸低分子化的问题，能够有效保持透明质酸内的有效大分子物质，进而保持透明质酸的粘弹性。本申请所述的牛冻精稀释液中各部分的作用是：透明质酸：是一种酸性粘多糖，透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子(Naturalmoisturizingfactor，NMF)例如：2％的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98％水分。透明质酸是一种大分子难溶的物质，透明质酸水溶液是一种非牛顿型流体，有着良好的粘弹性和流变形。将透明质酸加入牛冻精稀释液中，在使用时透明质酸包覆在精子周围，在精子周围形成膜结构，而且透明质酸具有良好的粘弹性和流变性，使整个精子的活动能力降低，使精子内蕴含的能量不受消耗，一旦精子进入输卵管，精子表面包覆的透明质酸被输卵管内的环境液降解后，精子恢复其原有的运动状态，精子内蕴含的能量被重新释放，将透明质酸加入冻精液中可以有效避免精子在保存期的能量消耗。肉碱：保护精子膜结构Tris：缓冲剂柠檬酸：溶质，可能也参与糖酵解；葡萄糖为精子代谢底物，用于给精子补充能量；卵黄：为低温休克精子膜保护剂；甘油：为渗透性冷冻保护剂；青霉素和链霉素为抗生素，二者的主要作用是抑制冻精稀释液中的微生物。冷冻精液质量检查本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛冻精稀释液，其特征在于，每100ml稀释液中包含以下组分：终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，终浓度为5mMol/ml～15mMol/ml的肉碱，终浓度为15％卵黄，终浓度为5％的甘油，终浓度为10％的青霉素，终浓度为10％的链霉素，终浓度为0.01％—1％的透明质酸水溶液，余量为灭菌蒸馏水。

【技术特征摘要】
1.一种牛冻精稀释液，其特征在于，每100ml稀释液中包含以下组分：终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，终浓度为5mMol/ml～15mMol/ml的肉碱，终浓度为15％卵黄，终浓度为5％的甘油，终浓度为10％的青霉素，终浓度为10％的链霉素，终浓度为0.01％—1％的透明质酸水溶液，余量为灭菌蒸馏水。2.一种如权利要求1所述的牛冻精稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)：配置0.01％—1％透明质酸水溶液将800ml量的灭菌水置于锥形瓶中，将终浓度为0.01％—1％的透明质酸加入灭菌水中，将锥形瓶置于水浴中加热溶解；步骤(2)：向步骤(1)水浴溶解后的透...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺亚南，高汉婷，生卫东，陈志南，衡振月，张志鹏，
申请(专利权)人：河南省鼎元种牛育种有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41