小鼠股骨诱导膜模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种小鼠股骨诱导膜模型的构建方法，包括以下步骤：1)将小鼠麻醉，在股骨内形成固定骨水泥占位器的钉道，随后在股骨中段处制造骨缺损；2)将带有通道的骨水泥占位器植入在骨缺损处，股骨髓内钉固定股骨；3)四周后收获诱导膜组织。本发明专利技术所述方法构建的小鼠股骨诱导膜模型，诱导膜形成良好，组织学证实其为小鼠诱导膜组织，可以提高试验的可靠性和重复性，为统一评价标准，奠定了良好的基础。

Construction method of mouse femur induced membrane model

The invention relates to a method for constructing a mouse femoral inducing membrane model, which comprises the following steps: 1) anaesthetizing the mouse, forming a nail channel for fixing a bone cement occupier in the femur, then making a bone defect in the middle part of the femur; 2) implanting a bone cement occupier with a channel into the bone defect, and fixing the femur with a femoral intramedullary nail; After four weeks, the membrane tissue was induced by harvest. The mouse femoral inducing membrane model constructed by the method of the invention has good inducing membrane formation, and is confirmed by histology as mouse inducing membrane tissue, which can improve the reliability and repeatability of the test and lay a good foundation for unified evaluation criteria.

【技术实现步骤摘要】
小鼠股骨诱导膜模型的构建方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种小鼠股骨诱导膜模型的构建方法。
技术介绍
高能量创伤常常会引起复杂的四肢损伤和较大节段的骨缺损。在骨缺损重建治疗方面，近年来，诱导膜技术深受医学界的重视。诱导膜技术又称Masquelet技术，主要方法是一期行骨水泥填充缺损，二期去除骨水泥，在骨水泥周围形成的诱导膜包壳中植入自体松质骨。大量临床数据表明，Masquelet技术在提高骨缺损重建治疗方面确有疗效。近年来，学者们对Masquelet技术进行了相关机制研究，不同种类的动物实验模型也有报道。然而，目前还没有形成一套较为标准的小鼠骨缺损诱导膜模型。目前，诱导膜技术已经成功应用于临床上大段骨缺损的治疗。然而，关于诱导膜如何促进成骨相关机制以及免疫系统发挥的作用却很少有学者深入研究。作为一种模型生物，小鼠被广泛用于骨骼相关研究。然而在大段骨缺损模型中，以小鼠做模型动物的甚少。这其中存在着实验材料不易制作、显微操作技术困难、实验动物死亡率高等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小鼠股骨诱导膜模型的构建方法，该方法构建的小鼠股骨诱导膜模型，诱导膜形成良好，组织学证实其为小鼠诱导膜组织，可以提高试验的可靠性和重复性，为统一评价标准，奠定了良好的基础。本专利技术的技术方案是：取小鼠，测量小鼠股骨的解剖参数，小鼠制备长度为3mm的股骨干中段骨缺损，用PMMA骨水泥股骨髓内钉固定股骨，术后观察小鼠活动情况，4周时骨水泥表面(周围)生长出诱导膜，取出骨水泥表面诱导膜组织，运用组织学染色观察、评估诱导膜生长情况。结果：术后小鼠骨缺损无法自行愈合，小鼠活动良好，骨水泥周围均有诱导膜形成，建模成功率100％。诱导膜组织H.E.染色发现股骨与骨水泥接触面有新生软骨，诱导膜厚度为300-600微米，诱导膜中少量血管新生血管以及大量的淋巴细胞聚集。本专利技术的技术方案具体如下：一种小鼠股骨诱导膜模型的构建方法，包括以下步骤：1)将小鼠麻醉，在股骨内形成与固定占位器的内通道连通的钉道，随后在股骨中段处制造骨缺损；2)将占位器植入在骨缺损处，用股骨髓内钉与股骨固定；3)四周后骨水泥表面获取诱导膜组织。步骤1)所述的骨缺损的长度为2.5-3mm。步骤1)所述在股骨内形成通道的方法是，沿股骨外侧白线钝性分离周围肌肉及软组织，显露股骨中下段，用穿刺针，经皮选取股骨髁间为入针点，穿透股骨远端皮质骨后到达股骨近端髓腔后，再旋转前进2mm并充分扩髓，形成与占位器连通的钉道。步骤1)所述通道的直径为0.5mm。步骤2)所述占位器用PMMA骨水泥制作成直径2mm，长度2.5-3mm圆柱形，并沿其中轴线设置通道。步骤2)中占位器与股骨固定的方法是，由股骨远端钉道穿入0.5mm不锈钢钢丝，穿过骨水泥占位器后到达股骨近端固定。所述的小鼠为C57品系小鼠。本专利技术选择C57品系小鼠作为实验模型动物，来源广泛，价格低廉，易于围术期管理，耐受手术和抗感染能力强。由于小鼠具有生长周期短，发育速度快的特点，用小鼠制造骨缺损诱导膜模型大大缩短了获取诱导膜的周期。C57品系小鼠作为分子生物学各个研究领域中最常见的研究动物，其测试条件成熟，测试试剂全面，便于应用多种实验手段更深入的开展诱导膜成骨相关机制的研究。股骨尺寸过小是建立小鼠骨缺损模型过程中面临的一大困难，建模过程中要求术者具备一定的显微外科手术基础。本专利技术利用显微手术器械，手术入路选取“白线”肌间隙进入，小心分离股骨周围肌肉，避免血管损伤。由股骨髁间入针，便于寻找解剖结构，易于准确定位，确保入针安全。利用线锯切割股骨中段，制造3mm长度骨缺损。为了能够确保小鼠股骨术后正常承重，申请人制作了骨水泥髓内钉系统作为骨缺损的固定装置，从股骨髁间入针，既能准确制造骨缺损，又便于植入骨水泥，同时保证了股骨缺损后的解剖对位和正常承重。实验结果证明，用自制髓内钉作为小鼠股骨内固定材料，具备足够的安全性和高效性，整个流程简便、可行，减少软组织剥离，尽量避免了局部血供的干扰，每只动物模型构建可在15分钟之内操作完成，建模成功率达到91.7％。通过自行设计的PMMA骨水泥股骨髓内钉成功制备了成年小鼠股骨骨缺损诱导膜模型，4周后诱导膜形成良好，组织学证实其为小鼠骨缺损诱导膜组织。采用本专利技术所述方法构建的模型，可重复小鼠股骨缺损诱导膜模型，解决了实验材料不易制作、显微操作技术困难、实验动物死亡率高等问题，为未来深入研究诱导膜修复骨缺损机制提供了一个良好的载体。附图说明图1为小鼠PMMA骨水泥股骨髓内钉固定术后X线表现；图2为骨水泥表面诱导膜；图3为术后4周组织病理变化，其中3A为诱导膜；3B为正常骨膜；3C为股骨与骨水泥接触端组织。图4为占位器在股骨中的示意图。具体实施方式实施例1小鼠股骨诱导膜模型的构建1.选择2-3月龄C57品系近交系的健康成年雌性小鼠(SPF级)40只，雌性，平均体±重40.5±2.8g，饲养温度25℃±2,相对湿度40％-70％，购自中的人民解放军陆军军医大学第二附属医院实验动物中心。2.解剖参数分析将6只小鼠颈椎脱臼法处死后分离解剖双侧股骨，共收集12条股骨样本，用游标卡尺测量股骨长度，股骨干中部和小转子平面的相关解剖参数，用于指导选择髓内针直径。3.小鼠股骨诱导膜模型的构建参见图4，取12只2-3月龄的FVB/N品系小鼠，术前禁食4-6小时，3％戊巴比妥钠(1.5ml/kg)腹腔注射麻醉，右侧股骨常规备皮、并固定于手术台，常规消毒铺巾，采用侧卧位将小鼠固定于操作台上，于大腿外侧作一长约1.5cm皮肤切口，沿股骨1外侧白线钝性分离周围肌肉及软组织，显露股骨中下段。采用1ml注射器针头作为穿刺针，经皮选取股骨髁间为入针点，穿透股骨远端皮质骨后到达股骨近端髓腔后，再旋转前进约2mm距离并充分扩髓，小心操作避免刺穿股骨大转子；应用0.22mm线锯在股骨中段处制造3mm骨缺损；由股骨内退出lml注射器针头，并记录其进入股骨内长度，根据该长度截取合适长短的0.5mm医用不锈钢钢丝作为髓内针；用5ml注射器针头扩张股骨髁间的入钉口；将PMMA骨水泥制作成直径2mm，长度3mm圆柱形占位器3，在其未完全凝固变硬之前沿中轴线制造直径为0.5mm通道4(髓内针钉道)；将骨水泥占位器植入骨缺损部位，由股骨远端钉道2穿入0.5mm不锈钢钢丝，穿过骨水泥占位器后到达股骨近端，将骨水泥占位器与股骨固定。术毕逐层缝合手术切口，无菌敷料包扎。术后连续3天碘伏消毒切口，腹腔注射青霉素20万U/kg，1次/d。小鼠苏醒后单独置于笼中饲养，室温维持在25±2℃，可进行自由活动以及进食和饮水。实施例2模型的观察1.X线片观察全部实验小鼠于术后7天拍摄X线片(型号德国西门子术中C臂机)，参见图1，观察PMMA骨水泥股骨髓内钉系统有无断钉、滑脱、移位以及骨缺损段有无成角畸形等情况。2.组织学观察4周后，所有实验鼠存活良好，采用颈椎脱臼法处死小鼠。离断右下肢，分离股骨周围肌群，完整游离股骨，显露股骨骨水泥表面诱导膜显露清晰，用尖镊完整剥离诱导膜，置于PBS溶液中保存。用4％的多聚甲醛溶液固定诱导膜组织；石蜡包埋后制作4um厚度组织切片，每个诱导膜组织切取10张石蜡切片，进行H.E.染色。实施例3模型的解剖结果1.股骨标本解剖参数测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠股骨诱导膜模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将小鼠麻醉，在股骨内形成与固定占位器的内通道连通的钉道，随后在股骨中段处制造骨缺损；2)将占位器植入在骨缺损处，用股骨髓内钉与股骨固定；3)四周后获取诱导膜组织。

【技术特征摘要】
1.一种小鼠股骨诱导膜模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将小鼠麻醉，在股骨内形成与固定占位器的内通道连通的钉道，随后在股骨中段处制造骨缺损；2)将占位器植入在骨缺损处，用股骨髓内钉与股骨固定；3)四周后获取诱导膜组织。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤1)所述的骨缺损的长度为2.5-3mm。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤1)所述在股骨内形成通道的方法是，沿股骨外侧白线钝性分离周围肌肉及软组织，显露股骨中下段，用穿刺针，经皮选取股骨髁间为入针点，穿透股骨远端皮质骨后到达股骨...

【专利技术属性】
技术研发人员：李杰，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50