一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群及其制备的免疫牛乳制造技术

本发明专利技术提供一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，利用该代表株群制备的奶牛疫苗，奶牛疫苗免疫奶牛制备的免疫牛乳和利用免疫牛乳中多克隆IgG抗体制备的生物制品，以用于满足临床特异性治疗幽门螺杆菌感染的需要，同时解决了细菌耐药性等问题。具有成本低、患者依从性好、可长期饮用等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群及其制备的免疫牛乳
本专利技术属于生物
，具体涉及一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，利用上述幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群制备的奶牛疫苗、用奶牛疫苗免疫奶牛后得到的免疫牛乳和利用免疫牛乳中多克隆IgG抗体制备生物制品的技术方法及其应用方法。
技术介绍
幽门螺旋杆菌，又称幽门螺杆菌，是与人类共同进化的一种病原菌，通常感染发生于幼年时期。据估计，世界上有一半以上的人口感染幽门螺杆菌，但是80%的感染者表现为没有明显临床症状的慢性胃炎；15-20%左右的感染者发展为溃疡；1-5%的感染者因为长期幽门螺旋杆菌引起的炎症反应进展为胃癌；还有不到1%发展为胃粘膜淋巴组织相关性淋巴瘤（MALT）。因此，1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构（WHO/IARC）又将幽门螺旋杆菌定为Ⅰ类致癌原。胃癌是一种高度致死性的很难治疗的癌症。在全世界，每年胃癌发病大约100万例，每年有超过70万人死于胃癌。因此，积极根除胃中的幽门螺杆菌是降低上述疾病发病率的根本方法。目前幽门螺旋杆菌的治疗是基于几种抗生素并联合PPI的治疗方法，该方法的不足是副作用大，病人耐受性差，治疗费用高，不能解决细菌耐药性，容易复发，不能获得免疫保护，影响胃肠道中的正常菌群等问题；同时，抗生素治疗根除率在逐年下降，从最早的90%多下降到现在60%多的根除率，因此寻求新的替代疗法迫在眉睫。在18世纪，人们用免疫动物的血清来治疗一些感染性疾病，但是随后发现，这些动物血清也是一种异源性蛋白，进入人体后可以引起较强的人体免疫反应，同时由于抗生素在感染性疾病治疗中的广泛运用，因此限制了这类抗体药物的开发和运用。随着抗生素的广泛运用，细菌耐药性的问题也越来越突出，人们也没有找到更好的办法来解决细菌耐药性问题，于是又重新思考和定位抗体药物的作用，希望能用老办法来解决新问题。研究员LizCarpenter发现给奶牛接种人类容易感染的病原菌如轮状病毒、艰难梭状芽胞杆菌、空肠弯曲杆菌等,这样生产出来的牛乳中含有抗体,人们饮用此种免疫牛乳不但可以获得营养而且可以帮助人们预防和治疗一些胃肠道感染性疾病。人工被动免疫治疗方法是治疗幽门螺杆菌感染的一种新方法，该方法就是用幽门螺杆菌免疫奶牛，刺激奶牛机体发生免疫应答，以分泌特异性抗幽门螺杆菌IgG抗体进入乳汁，然后收集这种免疫乳汁，经消毒处理后让幽门螺杆菌感染者服用，可以有效清除感染者胃中的幽门螺杆菌。但是，用该方法也面临诸多困难，比如需要用什么样的靶抗体、抗体能否穿过胃的粘液层、抗体能否不被胃酸破坏、需要抗体的剂量、抗体是否有足够的时间到达幽门定植部位、需要治疗多长时间、口服的最佳时间等等。幽门螺杆菌的基因分型主要是基于两个毒素基因：细胞空泡毒素（vacA）和细胞毒素相关蛋白（cagA）。根据cagA把临床菌株分为cagA阳性和cagA阴性两种菌株。幽门螺杆菌vacA基因由m区和s区两部分组成，vacA基因的5’有s1和s2两种类型，其中s2型中含有12个氨基酸氨基末端疏水性片段，而sl型没有该片段，据此sl又可分为sla型和slb型。根据其中间2区基因差异又可分为ml、mla、mlb、mlc、mlb-m2、m2a、m2b等类型。因而，这些等位基因理论上应该有多种不同的s与m组合，不同菌株可能有不同基因组合。随着对幽门螺旋杆菌株vacA基因分型工作的不断深入，vacA基因的多态性及不同地区优势基因型的分布逐渐开始清晰，例如研究发现北美以sla和slb型为主，二者比例接近；东欧和北欧是以sla型为主，而在南美主要以slb/ml型为主；日本和韩国以sla-ml型为主，占90％以上；而在国内不同地区vacA基因型的分布也存在差异，例如南京地区主要分布sla/ml和sla/m2型，西安地区以sla/ml居多，湖北地区则以sla-m2型为主。由于不同基因组合的幽门螺杆菌毒力不同，致病能力不同，感染后的临床结果也不同，因此需要建立幽门螺杆菌区域毒力流行株。然后用区域流行株制备出全菌疫苗，优势之一是全菌表面含有糖抗原，二是可以有效减少免疫菌和患者胃里幽门螺旋杆菌的差异。一般情况下80%的幽门螺杆菌定植在胃粘膜表面的25-100µm粘液层，少部分定植于胃粘膜上皮表面，胃小凹内及腺腔内。幽门螺杆菌寄居的部位比较特殊，是一个酸性环境，同时还要抵抗胃蠕动、胃排空以及胃粘液层的不断脱落和再生，因此幽门螺杆菌必须要借助粘附分子牢牢地粘附在细胞表面，而发挥粘附作用的分子主要位于细菌的表面。因此如果能获得抗粘附分子的抗体，抗体和细菌的粘附分子结合，就会使细菌失去粘附的能力，从而使细菌失去定植的能力，因此理想的候选疫苗抗原应该是位于病原菌的表面。位于幽门螺杆菌的表面的分子主要是外膜蛋白和脂多糖（LPS）。幽门螺旋杆菌基因组大约用4％基因编码大部分外膜蛋白（约64种外膜蛋白），这些独特的外膜蛋白满足了幽门螺杆菌适应独特的胃部环境的需要。这些外膜蛋白根据基因相似性分成五个基因家族。家族1包括hop家族（21个成员）和hor家族（12个成员）；家族2包括hof家族（8个成员)；家族3包括hom家族（4个成员）；家族4包括铁离子调节外膜蛋白（6个成员）；家族5包括泵外排蛋白（3个成员），还有10个成员没有纳入到上述分类中。在这些外膜蛋白中，目前已经确认和它们结合的受体，还有很多外膜蛋白的粘附受体还不是很清楚，因此目前用重组的办法制备出的疫苗还不能覆盖大部分感染者胃中的幽门螺杆菌.前期的研究表明，不同血型感染者由于表达的受体不同而感染状态不同，比如O型血更容易表达Leb抗原，O型血就更容易感染幽门螺杆菌，因此需要把感染者胃中的幽门螺旋杆菌按血型进行分组。与其他革兰氏阴性菌的外膜蛋白谱相比，幽门螺杆菌的外膜蛋白（OMP）谱没有占主导含量的蛋白，而是含有多种低丰度的外膜蛋白，因此如果只用幽门螺杆菌全菌作为免疫疫苗，获得抗外膜蛋白抗体的可能性非常小，因此需要富集外膜蛋白的办法作为疫苗去免疫奶牛。
技术实现思路
基于以上理论分析，因此最佳免疫疫苗是区域流行株毒力亚型混合全菌疫苗+外膜蛋白混合疫苗。考虑到分泌到牛乳中的抗体效价还达不到清除胃中幽门螺杆菌的作用，因此需要用高纯化琼脂糖包被的蛋白G提纯、分离和富集免疫牛乳中的多克隆IgG抗体再加入到免疫牛乳中，此种方法一是提高免疫牛乳抗体的效价，二是利用牛乳具有很强的缓冲能力，能提高胃液中的pH，使IgG得到很好的保护。为了保证抗体在胃中不被胃酸破坏，因此制备出来的免疫牛乳和多克隆IgG抗体需要搭配一定量中和胃酸的碱制剂。虽然80%的幽门螺杆菌定植在胃粘膜表面的25-100µm粘液层，但是有少部分定植于胃粘膜上皮表面，胃小凹内及腺腔内，甚至定植在细胞间隙或细胞内，因此抗体从粘液层表面到达细胞间隙还是比较困难的。要解决这个问题，可以通过长期每天饮用多克隆抗体，让抗体每天能够有小部分逐渐渗透到胃小凹内、腺腔内和细胞间隙。本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，利用该代表株群制备的奶牛疫苗，奶牛疫苗免疫奶牛制备的免疫牛乳、以及利用免疫牛乳中多克隆IgG抗体生物制品，以用于满足临床特异性治疗幽门螺杆菌感染的需要，同时解决了细菌耐药性等问题。具有成本低、患者依从本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，其特征在于，其包括保藏编号为CGMCCNo.15126的cagA+/cagE2/s1a/m1b/i1/iceA1代表株、保藏编号为CGMCCNo.15127的cagA+/cagE2/s1a/m2/i1/iceA1代表株、保藏编号为CGMCCNo.15128的cagA+/cagE2/s1a/m2/babA2/i1/iceA1代表株。

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，其特征在于，其包括保藏编号为CGMCCNo.15126的cagA+/cagE2/s1a/m1b/i1/iceA1代表株、保藏编号为CGMCCNo.15127的cagA+/cagE2/s1a/m2/i1/iceA1代表株、保藏编号为CGMCCNo.15128的cagA+/cagE2/s1a/m2/babA2/i1/iceA1代表株。2.一种利用权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群制备用于免疫奶牛的奶牛疫苗。3.根据权利要求2所述的奶牛疫苗，其特征在于，其通过如下方法制备：（A）将幽门螺杆菌感染者按ABO血型系统分为A、B、O三组，从不同血型幽门螺杆菌感染者胃中分离出幽门螺杆菌；（B）对每种血型分离出的幽门螺杆菌做cagA、cagE、vacA、iceA、babA2的PCR并测序；（C）对幽门螺杆菌的基因测序完成后，根据血型和基因组合：从A组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/cagE2/s1a/m2/i1/iceA1、B组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/cagE2/s1a/m1b/i1/iceA1、O组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/cagE2/s1a/m2/babA2/i1/iceA1三株流行代表株；（D）三株毒力亚型流行代表株通过扩增培养收集后，用PBS清洗三次，等比例混合配伍成1*109/毫升，制备出混合全菌奶牛疫苗，-20℃冻存备用。4.一种根据权利要求1所述的幽门螺杆菌株毒力亚型混合株群的外膜蛋白制备的奶牛疫苗。5.根据权利要求4所述的奶牛疫苗，其特征在于，其通过如下方法制备：1）以30块90mm细菌培养皿培养的细菌数量为1个单位，收集细菌，用10ml预冷的PBS，6000g，4℃离心5min，清洗细菌3次；2）每单位加入10ml预冷的Sulfo-NHS-SS-biotin反应液，4℃水平振荡30min；3）加入0.5mL反应终止缓冲液，4℃孵育5min；4）500g，4℃离心3min，弃上清；5）加入5mlTBS清洗细菌，500g，4℃离心5min，清洗2次；6）每单位加入10mL细菌裂解液，重悬细菌，转移至15ml离心管中；7）4℃条件下，反复颠倒离心管，裂解细菌1h；8）超声破碎，1son/6off，5min；9）12,000g，4℃离心30min，收集上清；10）用清洗缓冲液平衡StreptavidinHP层析柱，将第9步的上清液进样到层析柱中，上样2-3次；11）用清洗缓冲液清...

【专利技术属性】
技术研发人员：单保恩，赵川，史中立，胡代伦，赵连梅，刘维华，徐保红，殷长甫，王苋，
申请(专利权)人：河北医科大学第四医院，石家庄市疾病预防控制中心石家庄市卫生检测中心，河北医科大学临床学院，
类型：发明
国别省市：河北,13