一种测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒及其制备方法，检测垫上设有检测线T1、检测线T2和质控线，检测线T1上包被有钙卫蛋白单克隆抗体，检测线T2上包被有血红蛋白单克隆抗体，质控线上包被有羊抗鼠或羊抗兔IgG，标记垫上包被有量子点标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点标记的血红蛋白单克隆抗体的混合物，所述量子点为两种不同颗粒粒径的混合物。本发明专利技术的试剂盒可以同步检测粪便中的钙卫蛋白和便潜血，可以快速简便的判断肠粘膜损伤程度，检测灵敏度高，特异性好。

A combined detection kit for detecting intestinal mucosal injury and its preparation method

The invention belongs to the field of biological detection, in particular relates to a combined detection kit for detecting intestinal mucosal injury and a preparation method thereof. The detection pad is provided with a detection line T1, a detection line T2 and a quality control line, the detection line T1 is coated with a monoclonal antibody against calmetin, the detection line T2 is coated with a monoclonal antibody against hemoglobin, and the quality control line is coated with a detection line T2. Mixture of a monoclonal antibody to calmetin labeled with a quantum dot and a monoclonal antibody to hemoglobin labeled with a quantum dot coated on the label pad of a sheep or sheep anti-rabbit IgG, the quantum dot being a mixture of two different particle sizes. The kit of the invention can simultaneously detect the calmetin in the feces and the occult blood in the feces, can quickly and conveniently judge the degree of intestinal mucosa damage, has high detection sensitivity and good specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒及其制备方法
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
钙卫蛋白(calprotectin)属于S-100家族，是一个相对分子质量为36kDa的钙-锌结合蛋白，由两条MRP-8链和一条MRP-14链构成的异源三聚体，主要来源于中性粒细胞，是中性粒细胞更新的重要标志物。粪便中钙卫蛋白的出现是肠胃增生性疾病和肠道炎症感染性疾病的标志。一般情况下，单从疾病症状上很难区分急性肠道激惹所引起的不适病症与慢性感染性胃肠道疾病，从而导致了无必要及过度的肠镜滥用，钙卫蛋白是急性胃肠道感染的一种标志，并且由此可以判断感染的程度。便隐血(FOBT)：也称为便潜血，是指消化道出血量很少时，红细胞也被破坏，血红蛋白分子释放到粪便中，粪便外观无异常改变，肉眼和显微镜均不能证实的出血，只能化学方法或免疫学方法检测到。由于肠道的出血是间断性的，不是持续性出血，出血速度可能低于或超出潜血试验的检测阈值等原因，便潜血试验的敏感性还是不尽人意。同粪便潜血相比较，粪便钙卫蛋白能发现早期不出血病灶，而且结果不受全身情况、饮食成分、一般药物及营养支持治疗的影响。目前评价肠炎的金标准是结肠镜活检。这项技术可以让我们对肠道进行目测检查，并且能够获得粘膜活检标本用于组织学检查。疾病的位置、范围和严重性都可以用这种方法确立，但是它具有侵害性，不能检查全部的胃肠道，而且需要熟练的操作员和不舒服的肠道准备。无线胶囊内镜使我们能够形象化的看到整个小肠。然而，这种检查也有点侵害性且受到费用和不能够获得组织样本的限制，从而阻碍了内镜技术对疾病活动性的评估。这样，用一个简单、快速、灵敏、特异和非侵入性的标志物去检测和监控炎症性肠病患者是非常有必要的。粪便钙卫蛋白(FC)具有这些特性。同结肠镜相比，粪便钙卫蛋白和便潜血的检测具有简便、经济、无创性等优点，一定程度上可以避免结肠镜检查的痛苦，弥补患者不能随时复查的不足。为了能够准确测定肠粘膜损伤，很多时候需要同时测定粪便中钙卫蛋白及潜血症状。目前，检测便潜血的试剂相对较多，但是都是定性检测，没有定量检测的试剂。粪便钙卫蛋白的检测试剂很少，只有酶联免疫和胶体金免疫层析的方法。酶联免疫的方法存在操作繁琐，检测时间长和无法及时进行单人份检测等诸多问题；胶体金免疫层析的方法虽然操作简便，检测时间短，但是存在检测灵敏度较低和检测线性范围窄等因素，检测结果不准确。
技术实现思路
本专利技术主要提供了一种测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒可以同步检测粪便中的钙卫蛋白和便潜血，可以快速简便的判断肠粘膜损伤程度，检测灵敏度高，特异性好。一种测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒，包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底板，底板的一面上顺序搭接有吸水垫、检测垫、标记垫、第一样品垫和第二样品垫，检测垫上设有检测线T1、检测线T2和质控线，检测线T1上包被有钙卫蛋白单克隆抗体，检测线T2上包被有血红蛋白单克隆抗体，质控线上包被有羊抗鼠或羊抗兔IgG，标记垫上包被有量子点标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点标记的血红蛋白单克隆抗体的混合物，所述量子点标记的钙卫蛋白单克隆抗体为量子点荧光微球标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的钙卫蛋白单克隆抗体混合而成，所述量子点标记的血红蛋白单克隆抗体为量子点荧光微球标记的血红蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的血红蛋白单克隆抗体混合而成，所述量子点荧光微球的粒径与量子点修饰物的粒径不同。优选的，所述量子点荧光微球为量子点与微球的复合物，量子点荧光微球表面带有基团，其粒径为150-180nm，所述量子点修饰物为量子点表面经基团修饰而成，其粒径为20-50nm，所述量子点为硅、锗、硫化镉、碲化镉、硒化锌、硫化铅、硒化铅、砷化铟、硒化镉或膦化铟，所述微球为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯甲苯微球或二氧化硅微球。优选的，所述基团为羧基，量子点荧光微球标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的钙卫蛋白单克隆抗体的混合比例为1:0.1-10。优选的，检测垫的材质为硝酸纤维素膜，标记垫的材质为玻璃纤维素。优选的，所述试剂盒对钙卫蛋白的检测灵敏度达到0.1ng/ml，对血红蛋白的检测灵敏度达到5ng/ml。一种上述测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(Ⅰ)标记垫的制备取量子点荧光微球标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的钙卫蛋白单克隆抗体按照1:0.1-10的比例混合，形成量子点标记的钙卫蛋白单克隆抗体，取量子点荧光微球标记的血红蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的血红蛋白单克隆抗体按照1:0.1-10的比例混合，形成量子点标记的血红蛋白单克隆抗体，将量子点标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点标记的血红蛋白单克隆抗体按照1:1的比例混合，将混合液喷涂在玻璃纤维素垫上，干燥，备用；(Ⅱ)检测垫的制备取硝酸纤维素膜，间隔划出检测线T1、检测线T2和质控线，检测线T1上包被钙卫蛋白单克隆抗体，检测线T2上包被血红蛋白单克隆抗体，质控线上包被羊抗鼠或羊抗兔IgG，将包被好的硝酸纤维素膜干燥，备用；(Ⅲ)免疫层析试纸条制备在底板上依次搭接吸水垫、检测垫、标记垫、第一样品垫和第二样品垫，组装完毕后剪切成条即可；(Ⅳ)试剂盒组装将试纸条装入塑料板卡上，扣上上盖，密封保存。优选的，步骤(Ⅰ)中，量子点荧光微球标记的钙卫蛋白/血红蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的钙卫蛋白/血红蛋白单克隆抗体的制备方法为：取量子点荧光微球或量子点修饰物，加入标记缓冲液中，混匀后，分别使用不同的活化缓冲液活化，活化完成后，加入钙卫蛋白单克隆抗体或血红蛋白单克隆抗体，超声混匀并振荡反应，然后加入封闭缓冲液进行封闭反应，最后离心去上清液，对沉降的固体重悬，超声混匀即可。优选的，所述标记缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，所述活化缓冲液为N-羟基琥珀酰亚胺活化缓冲液和碳二亚胺活化缓冲液，所述封闭缓冲液为甘氨酸溶液和酪蛋白钠溶液。采用上述方案，本专利技术具有以下优点：(1)在判断肠粘膜损伤时，通常需要首先确定是急性胃肠道感染还是慢性感染性胃肠道疾病，并且需辨别是否有潜血症状，本专利技术试剂盒可以联合检测粪便中的钙卫蛋白和便潜血，能够快速判断是否是急性胃肠道感染，对于不出血的肠道病灶也能检测的出，对于肠粘膜损伤疾病的诊断具有重要意义。通过实现联检，使用通用的样本缓冲液，一次加样，可以同时获得两个结果，联合检测可以提高检测的灵敏度和特异性。不仅如此，对于单克隆抗体，采用不同粒径混合的量子点标记，既能提高检测灵敏度，又提高了检测的线性范围；(2)通常情况下，钙卫蛋白的检测，如果使用胶体金的方法，检测的灵敏度只能做到20ng/ml，其线性范围大概在30-600ng/ml。使用ELISA的方法，灵敏度大概在1-5ng/ml，线性范围大概在5-1200ng/ml。临床的样本有一部分会超过1200ng/ml的含量，遇到这样的样本，需要进行稀释后重新检测，而采用本方法，可以完全覆盖所有样本的检测，最高可以检测到4000ng/ml的量，不仅如此，对钙卫蛋白的检测灵敏度可以达到0.1ng/ml。目前对于FOB的检测，市面上的大多数产品都只能做到200ng/ml的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒，其特征在于：包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底板(1)，底板(1)的一面上顺序搭接有吸水垫(2)、检测垫(3)、标记垫(4)、第一样品垫(5)和第二样品垫(6)，检测垫(3)上设有检测线T1、检测线T2和质控线，检测线T1上包被有钙卫蛋白单克隆抗体，检测线T2上包被有血红蛋白单克隆抗体，质控线上包被有羊抗鼠或羊抗兔IgG，标记垫(4)上包被有量子点标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点标记的血红蛋白单克隆抗体的混合物，所述量子点标记的钙卫蛋白单克隆抗体为量子点荧光微球标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的钙卫蛋白单克隆抗体混合而成，所述量子点标记的血红蛋白单克隆抗体为量子点荧光微球标记的血红蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的血红蛋白单克隆抗体混合而成，所述量子点荧光微球的粒径与量子点修饰物的粒径不同。

【技术特征摘要】
1.一种测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒，其特征在于：包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底板(1)，底板(1)的一面上顺序搭接有吸水垫(2)、检测垫(3)、标记垫(4)、第一样品垫(5)和第二样品垫(6)，检测垫(3)上设有检测线T1、检测线T2和质控线，检测线T1上包被有钙卫蛋白单克隆抗体，检测线T2上包被有血红蛋白单克隆抗体，质控线上包被有羊抗鼠或羊抗兔IgG，标记垫(4)上包被有量子点标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点标记的血红蛋白单克隆抗体的混合物，所述量子点标记的钙卫蛋白单克隆抗体为量子点荧光微球标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的钙卫蛋白单克隆抗体混合而成，所述量子点标记的血红蛋白单克隆抗体为量子点荧光微球标记的血红蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的血红蛋白单克隆抗体混合而成，所述量子点荧光微球的粒径与量子点修饰物的粒径不同。2.根据权利要求1所述的测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒，其特征在于：所述量子点荧光微球为量子点与微球的复合物，量子点荧光微球表面带有基团，其粒径为150-180nm，所述量子点修饰物为量子点表面经基团修饰而成，其粒径为20-50nm，所述量子点为硅、锗、硫化镉、碲化镉、硒化锌、硫化铅、硒化铅、砷化铟、硒化镉或膦化铟，所述微球为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯甲苯微球或二氧化硅微球。3.根据权利要求2所述的测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒，其特征在于：所述基团为羧基，量子点荧光微球标记的钙卫蛋白单克隆抗体与量子点修饰物标记的钙卫蛋白单克隆抗体的混合比例为1:0.1-10。4.根据权利要求1所述的测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒，其特征在于：检测垫(3)的材质为硝酸纤维素膜，标记垫(4)的材质为玻璃纤维素。5.根据权利要求1所述的测定肠粘膜损伤的联合检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒对钙卫蛋白的检测灵敏度达到0.1ng/ml，对血红蛋白的检测灵敏度达到5ng/ml。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小冬，高省，
申请(专利权)人：常州领航量子生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32