受试物质的检测方法及受试物质的检测用试剂盒技术

本发明专利技术提供受试物质的检测方法包括：使受试物质、标记抗体、捕获抗体、第1固相接触，在第1固相上形成免疫复合物的工序，通过解离捕获抗体和第1固相的结合来使免疫复合物游离，使与捕获抗体结合的第2固相和免疫复合物接触，向第2固相上转移免疫复合物的工序和测定第2固相上的复合物中所含的标记而检测受试物质的工序。用此方法检测的受试物质是多聚体的抗原、特别是淀粉样蛋白β或τ蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】受试物质的检测方法及受试物质的检测用试剂盒
本专利技术涉及受试物质的检测方法及受试物质的检测用试剂盒。
技术介绍
作为免疫学测定法广泛使用的夹心免疫测定是使标记抗体和捕获抗体与试样中的抗原结合，基于标记检测抗原的方法。在夹心免疫测定中，由于如果标记抗体的表位和捕获抗体的表位重复，则因立体障碍而仅某个与抗原结合而检测变得无法进行，通常使用表位不同的2种抗体。但是，当抗原是多聚体时，抗原上会存在多个相同的表位。当以表位重复的2种抗体作为标记抗体及捕获抗体使用时，会检测不到单体，而检测到多聚体。例如，在专利文献1或非专利文献1中记载了使用检测抗体和捕获抗体的夹心免疫测定。在这些文献中，由于检测抗体的表位和捕获抗体的表位相同或重叠，可检测淀粉样蛋白β的多聚体。在非专利文献2～4中，记载了使用检测抗体和2种捕获抗体的夹心免疫测定。在这些文献中，由于检测抗体的表位和2种捕获抗体的表位全部相同或重叠，可检测淀粉样蛋白β的多聚体。【现有技术文献】【专利文献】专利文献1：美国专利申请公开第2010/021943号说明书【非专利文献】非专利文献1：Savage,etal.,J.Neuroscience2014,34(8):2884-97非专利文献2：LeVineIII,Anal.Biochem.335(2004)81-90非专利文献3：Kamali-Moghaddam,etal.,BMCNeuroscience2010,11:124非专利文献4：Wang-Dietrich,etal.,J.Alzheimer’sDisease34(2013)985-94【专利技术的概要】【专利技术要解决的课题】本专利技术的目的是提供对抗原免疫学地进行测定的新方法。【用于解决课题的手段】本专利技术提供受试物质的检测方法。此方法包括：使受试物质和与受试物质结合的标记抗体、与物质结合的第1捕获抗体、与受试物质结合的第2捕获抗体、及与第1捕获抗体结合的第1固相接触，在第1固相上形成含受试物质、标记抗体、第1捕获抗体及第2捕获抗体的复合物的工序，通过解离第1捕获抗体和第1固相的结合而使复合物游离，使与第2捕获抗体结合的第2固相和复合物接触，向第2固相上转移复合物的工序，对第2固相上的复合物中所含的标记进行测定，检测物质的工序。在此方法中，受试物质是多聚体，标记抗体的表位、第1捕获抗体的表位及第2捕获抗体表位重复。另外，本专利技术提供不同的实施方式的受试物质的检测方法。此方法包括：使受试物质、与受试物质结合的标记抗体、与受试物质结合的捕获抗体、与捕获抗体结合的第1固相接触，在第1固相上形成含受试物质、标记抗体、及捕获抗体的复合物的工序，通过解离捕获抗体和上述第1固相的结合而使复合物游离，使与捕获抗体结合的第2固相和复合物接触，向第2固相上转移复合物的工序，对第2固相上的复合物中所含的标记进行测定，检测受试物质的工序。在此方法中，受试物质是多聚体，标记抗体的表位及捕获抗体的表位重复。另外，本专利技术提供不同的实施方式的受试物质的检测方法。此方法包括：使受试物质、与受试物质结合的标记抗体、与受试物质结合的捕获抗体、及与捕获抗体结合的第1固相接触，使含受试物质、标记抗体及捕获抗体的复合物在第1固相上形成的工序，通过解离捕获抗体和第1固相的结合而使第1固相上的复合物游离，转移到与捕获抗体结合的第2固相的工序，对第2固相上的复合物中所含的标记进行测定，检测受试物质的工序。在此方法中，受试物质是淀粉样蛋白β或τ蛋白质。【专利技术的效果】根据本专利技术，提供免疫学地测定抗原的新方法。【附图说明】【图1】显示第1实施方式的测定机理。【图2】显示第2实施方式的测定机理。【图3】显示第3实施方式的测定机理。【图4】显示试剂盒的一例。【图5】显示试剂盒的一例。【图6】是显示实施例1及比较例1的结果的坐标图。【图7】是显示实施例2的结果的坐标图。【图8】是显示实施例3的结果的坐标图。【图9】是显示实施例4的结果的坐标图。【图10】是显示实施例5的结果的坐标图。【具体实施方式】在作为本专利技术的一实施方式的受试物质的检测方法中，由包括后述的各工序的免疫复合物转移法(以下，也称为“ICT-EIA”)检测受试物质。以下，对于本专利技术的实施方式进行说明。[第1实施方式]在本实施方式中，作为受试物质检测到多聚体。“多聚体”也称为聚合物，多个单体分子物理学－化学地聚合或凝集而形成。作为单体分子，例示多肽、核酸、糖链等。作为多肽的多聚体，具体而言，例示淀粉样蛋白β单体聚合的淀粉样蛋白β寡聚体、τ蛋白质聚合的τ寡聚体等。除此之外，例示血清-淀粉样-A-蛋白质-凝集体、IgG-轻链-凝集体、AapoAI-凝集体、AapoAII-凝集体、ATTR-凝集体、DISC1-凝集体、FUS-凝集体、IAPP-凝集体、SOD1-凝集体、α-突触核蛋白-凝集体、TDP-43-凝集体、Huntingtin-凝集体、溶菌酶-凝集体等。“多聚体”含多个单体分子即可，也可含此外的分子。“多聚体”无单体分子彼此必然由共价键等强固地结合的必要，也包括由更缓和的结合凝集而集合的凝集体。淀粉样蛋白β是通常由40个左右的氨基酸构成的多肽，有凝集而形成不溶性的淀粉样纤维的性质。τ蛋白质也称为“τ”，是分子量约5万的蛋白质，有结合到细胞内的微小管而使细胞骨架稳定化等的功能。在人中，τ蛋白质因外显子2、外显子3及外显子10的选择性剪接而存在6种同种型。在本说明书中，“τ蛋白质”或“τ”的词语只要是不特别言及，就还含任何的同种型。受试物质含在生物来源的试样中。作为试样，例示从生物体或死体采集的试样、培养细胞等。具体而言，例示脑组织、血液(全血)、血浆、血清、脑脊髓液等。生物种不特别限定，可从人或人以外的哺乳动物采集。【复合物的形成工序】在本实施方式的检测方法中，进行使受试物质和与受试物质结合的标记抗体、与受试物质结合的第1捕获抗体、与受试物质结合的第2捕获抗体、及与第1捕获抗体结合的第1固相接触，在上述第1固相上形成含受试物质、标记抗体、第1捕获抗体及第2捕获抗体的复合物的工序。在本说明书中，“抗体”也包括Fab、F(ab')2等的抗原结合性抗体片段或其衍生物。形成工序通常在溶液中进行。在本实施方式中，标记抗体的表位、第1捕获抗体的表位及第2捕获抗体的表位重复。“表位重复”是指这些抗体的表位相同或部分一致。通过表位相同或部分一致，对于单体分子的表位而结合了仅1个抗体，此外的抗体因立体障碍抑制结合。在免疫学测定法中，通过使用表位重复的多种抗体而检测到含表位多个多聚体。特别是，由于在本实施方式中使用3种抗体，单体分子的检测及含2分子单体的多聚体(二聚体)的检测被抑制，适宜地检测到含3分子以上单体的多聚体。标记抗体只要是可与受试物质特异性地结合，并且被免疫学方法中惯用的公知的标记物质标记的抗体，就不特别限定。这样的标记抗体可通过由使用适当的交联剂或市售的标记试剂盒等的公知的方法，使抗体和标记物质结合或连接来制作。标记物质只要是可发能测定的信号的物质，就不特别限定，例如，可举出酶、荧光物质、放射性同位素等。作为酶，可举出碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(FITC)等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.受试物质的检测方法，其包括：使受试物质和与上述受试物质结合的标记抗体、与上述受试物质结合的第1捕获抗体、与上述受试物质结合的第2捕获抗体、及与上述第1捕获抗体结合的第1固相接触，在上述第1固相上形成含上述受试物质、上述标记抗体、上述第1捕获抗体及上述第2捕获抗体的复合物的工序，通过解离上述第1捕获抗体和上述第1固相的结合来使上述复合物游离，使与上述第2捕获抗体结合的第2固相和上述复合物接触，向上述第2固相上转移上述复合物的工序，及对上述第2固相上的复合物中所含的标记进行测定，检测上述受试物质的工序，上述受试物质是多聚体，上述标记抗体的表位、上述第1捕获抗体的表位及上述第2捕获抗体表位重复。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.08 JP 2016-0216101.受试物质的检测方法，其包括：使受试物质和与上述受试物质结合的标记抗体、与上述受试物质结合的第1捕获抗体、与上述受试物质结合的第2捕获抗体、及与上述第1捕获抗体结合的第1固相接触，在上述第1固相上形成含上述受试物质、上述标记抗体、上述第1捕获抗体及上述第2捕获抗体的复合物的工序，通过解离上述第1捕获抗体和上述第1固相的结合来使上述复合物游离，使与上述第2捕获抗体结合的第2固相和上述复合物接触，向上述第2固相上转移上述复合物的工序，及对上述第2固相上的复合物中所含的标记进行测定，检测上述受试物质的工序，上述受试物质是多聚体，上述标记抗体的表位、上述第1捕获抗体的表位及上述第2捕获抗体表位重复。2.权利要求1所述的方法，其中上述受试物质含多肽。3.权利要求1或2所述的方法，其中上述受试物质是三聚体以上的多聚体。4.权利要求1～3之任一项所述的方法，其中上述受试物质是淀粉样蛋白β或τ蛋白质。5.权利要求1～4之任一项所述的方法，其中上述第1捕获抗体含第1结合物质，上述第1固相含与上述第1结合物质特异性地结合的第1结合偶体，在上述形成工序中，由上述第1结合偶体和上述第1结合物质的特异性结合，上述复合物结合于上述第1固相上，上述第2捕获抗体含第2结合物质，上述第2固相含与上述第2结合物质特异性地结合的第2结合偶体，在上述转移工序中，由上述第2结合偶体和上述第2结合物质的特异性结合，游离的上述复合物与上述第2固相结合。6.在权利要求1～5之任一项所述的方法中使用，含上述标记抗体、上述第1捕获抗体、及上述第2捕获抗体的，受试物质的检测试剂盒。7.受试物质的检测方法，其包括：使受试物质、与上述受试物质结合的标记抗体、与上述受试物质结合的捕获抗体、与上述捕获抗体结合的第1固相接触，在上述第1固相上形成含上述受试物质、上述标记抗体、及上述捕获抗体的复合物的工序，通过解离上述捕获抗体和上述第1固相的结合来使上述复合物游离，使与上述捕获抗体结合的第2固相和上述复合物接触，向上述第2固相上转移上述复合物的工序，对上述第2固相上的复合物中所含的标记进行测定，检测上述受试物质的工序，上述受试物质是多聚体，上述标记抗体的表位及上述捕获抗体的表位重复。8.权利要求7所述的方法，其中上述受试物质含多肽。9.权利要求7或8所述的方法，其中上述受试物质是二聚体以上的多聚体。10.权利要求7～9之任一项所述的方法，其中上述受试物质是淀粉样蛋白β或τ蛋白质。11.权利要求7～10之任一项所述的方法，其中上述捕获抗体含第1结合物质及第2结合物质，上述第1固相含与上述第1结合物质特异性地结合的第1结合偶体，上述第2固相含与上述第2结合物质特异性地结合的第2结合偶体，在上述形成工...

【专利技术属性】
技术研发人员：渡边敏弘，
申请(专利权)人：希森美康株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP