多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法，解决了现有疫苗佐剂注射困难、免疫力较低的问题。技术方案包括先将免疫增强剂溶于生理盐水中得内部水相；再将乳化剂和助表面活性剂溶解于非矿物油中，混匀，得中间油相；然后将内部水相缓慢加入到中间油相中，600～1200rpm的转速下自乳化，得稳定的油包水初乳；再将亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂加入到生理盐水中，磁力搅拌充分混匀，得外部水相；最后将油包水初乳加入到外部水相中乳化，得到多重纳米乳疫苗佐剂。本发明专利技术方法乳液稳定性好，黏度低(＜90mPa·s)，疫苗佐剂具有合理的控释、靶向和隔离特性。

【技术实现步骤摘要】
多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法
本专利技术涉及一种疫苗佐剂的制备方法，具体的说是一种多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法。
技术介绍
疫苗佐剂是指先于抗原或与抗原同时应用，能够非特异地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，以及增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身无抗原性的物质。佐剂能够诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本。通常疫苗佐剂根据剂型分为三类，分别为水包油(O/W)型，油包水(W/O)型和水包油包水(W/O/W)型(又称多重乳液)。目前国内外公认的W/O/W型疫苗佐剂是ISA206，具有一定的稳定性，在全球范围内得到了广泛应用。其不足之处是所制备的ISA206佐剂的稳定性还不令人满意，且粒径较大，属于微米级别。而纳米乳是一类乳滴粒径尺度范围非常小(20～500nm)、外观呈透明或半透明、热力学稳定的分散体系。将纳米乳作为一种新型药物的的载体，能有效提高难溶性药物的溶解度，促进大分子药物在体内的吸收，从而提高药物的生物利用率，同时具有安全性高，稳定性好等优点，广泛用于医药领域。因此，通过纳米化技术制备稳定的W/O/W型疫苗佐剂具有极其重要的现实意义和市场价值。CN103223164公开了一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法。专利技术中使用免疫增强剂提高疫苗免疫效力，所述免疫增强剂为黄芪多糖注射液。该技术公开的是一种水包油包水型佐剂疫苗，粒径在1.0～3.9μm之间，且制备原料上仍选择白油，并需添加硬脂酸铝作为稳定剂，未提及所制疫苗对动物的安全性影响，容易导致疫苗在注射机体后注射阻力大，不易吸收，矿物油不易代谢，产生大量无菌脓肿和肉芽肿，对动物胴体品质造成不良影响。CN101428145公开了一种纳米微粒佐剂及其制备方法和其在制备灭活疫苗中的应用。该技术公开的是一种水包油的纳米乳佐剂，虽然粒径在10～200nm之间，在制备过程中需经历高压均质处理过程，容易导致抗原效价降低甚至失活。不仅如此，虽然在文件中记载了可以使用动植物油替代矿物油，所述动植物油选自棉籽油、花生油、杏仁油或角鲨烯。但是其全部实施例使用的仍是“白油”，并无使用非矿物油的实施例。事实上，虽然本领域技术人员都知道采用非矿物油替代矿物油更利于动物体内代谢，但由于所采用的原料和制备工艺的不同，在乳液稳定性、黏度和粒径等方面，非矿物油相较于矿物油具有劣势，这也是动植物类非矿物油未在生产中应用的原因。迄今为止，多重纳米乳疫苗佐剂的开发鲜有报道，这与其开发工艺的难度密切相关，现有技术的多重纳米乳疫苗佐剂由于配方成分、制备工艺不够合理，因此在使用环节仍存在注射困难、免疫力较低的缺陷。在这种情况下，迫切需要研制出一种高效疫苗佐剂，进而提高兽用疫苗的效力和免疫时间，将会为家畜养殖业预防疾病带来很广阔的市场前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述技术问题，提供一种工艺简单、易于生产、产品稳定性好、粒径小、黏度低、易于吸收降解、免疫增强效果好、对机体刺激性小的多重纳米乳疫苗佐剂。1.按照以下步骤进行：1)将免疫增强剂溶于生理盐水中，混匀，得内部水相；2)将乳化剂和助表面活性剂溶解于非矿物油中，混匀，得中间油相；3)将内部水相缓慢加入到中间油相中，600～1000rpm的转速下自乳化，得稳定的油包水初乳；4)将亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂加入到生理盐水中，磁力搅拌充分混匀，得外部水相；5)将油包水初乳加入到外部水相中，8000～10000rpm的剪切速度下乳化，得到由内部水相、中间油相以及外部水相组成的多重纳米乳疫苗佐剂。进一步的，得到的多重纳米乳疫苗佐剂中，内部水相中的各组分，按多重纳米乳疫苗佐剂的总重量计，为：免疫增强剂0.5～2.5％；中间油相中的各组分，按多重纳米乳疫苗佐剂的总重量计，为：乳化剂0.2～1％、助表面活性剂0.2～1％、非矿物油3～10％；外部水相中各组分，按多重纳米乳疫苗佐剂的总重量计，为：亲水性表面活性剂2～7％、亲油性表面活性剂1～6％、余量为生理盐水。优选的，所述乳化剂为聚氧乙烯蓖麻油、卵磷脂、甘露醇单油酸酯或聚乙二醇单油酸酯中的至少一种。优选的，所述助表面活性剂为聚乙二醇、乙醇或甘油中的至少一种。优选的，所述非矿物油为花生油、角鲨烯或棕榈油中的至少一种。优选的，所述亲水性表面活性剂为Tween85、Tween80、Tween60、或Tween20中的至少一种。优选的，所述亲油性表面活性剂为Span80、Span60、Span40、或Span20中的至少一种。优选的，所述免疫增强剂为黄芪多糖注射液、香菇多糖注射液、枸杞多糖注射液或党参多糖注射液中的至少一种。为解决
技术介绍
中存在的问题，使用具有能在体内代谢特点的非矿物油替代矿物油，并进行如下改进：(1)制备水包油包水的多重乳液结构，将油相置于中间层，降低黏度和刺激性，安全性更好，免疫保护率更高；(2)对工艺过程的步骤2进行了改进，将过去向搅拌的水相中加入油相的技术手段，变为向油相中加入水相进行自乳化后，再在低能搅拌下进行乳化，这是基于非矿物油具有特殊极性的特点，水相持续加入油相时不宜同步搅拌，会造成由最初的油包水相转变成水包油，而将自乳化制备的油包水再在低速搅拌下加入外水相，达到制备多重乳液的目的，从而解决非矿物油加入带来的产品稳定性差和黏度高的问题。(3)由于本专利技术疫苗佐剂为多重纳米乳，更易制成微米大小的粒径，而不易制成纳米级别。专利技术人特别采用高速剪切替代高压均质进行纳米处理，可以获得500nm以内的乳液且分散性、均一性好，同时也避免由高压均质导致的抗原效价降低甚至失活的问题发生。(4)在外部水相中同时含有亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，同时含有亲水和亲油表面活性剂可以使外层膜更好的兼容于中间油相和外水相，达到稳定乳液的目的。进一步的，基于非矿物油和矿物油的不同特性，所述中间油相中的非矿物油的添加量应严格限定，占总重量的5.2～6.4％，过多会造成乳液粒径显著增大且稳定性降低，过少不利于发挥非矿物油的免疫增强性。所述乳化剂占0.8～1.4％，过多会内水相含量降低，过少会使初乳稳定性降低。助表面活性剂的作用是与乳化剂相结合，更有利于发生自乳化，添加控制在0.8～1.4％，过多会造成最终制备的乳液在安全性上有一定影响，过少会不利于形成自乳化。有益效果：本专利技术工艺简单、易于操作、生产成本低，制备的纳米乳粒径在500nm以内，乳液稳定性好，黏度低(＜90mPa·s)，疫苗佐剂具有合理的控释、靶向和隔离特性，注射免疫家禽后，水包油包水微球适时代谢破裂，内水相中抗原和免疫增强剂缓慢持久释放，全面刺激家禽淋巴细胞产生抗体和增强免疫细胞增殖能力，使其生物利用度达到最大化，表现为注射部位吸收良好、被注射动物快速产生免疫保护作用。附图说明图1-4为分别为实施例1-4的多重纳米乳疫苗佐剂透射电镜图。图5和图6分别为对比例1和对比例2制备的疫苗佐剂透射电镜图。图7为各试验组小鼠淋巴细胞增殖情况(OD490)分析图。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术作进一步说明，但并不局限于此。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：1)将免疫增强剂溶于生理盐水中，混匀，得内部水相；2)将乳化剂和助表面活性剂溶解于非矿物油中，混匀，得中间油相；3)将内部水相缓慢加入到中间油相中，600～1200rpm的转速下自乳化，得稳定的油包水初乳；4)将亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂加入到生理盐水中，磁力搅拌充分混匀，得外部水相；5)将油包水初乳加入到外部水相中，8000～12000rpm的剪切速度下乳化，得到由内部水相、中间油相以及外部水相组成的多重纳米乳疫苗佐剂。

【技术特征摘要】
1.一种多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：1)将免疫增强剂溶于生理盐水中，混匀，得内部水相；2)将乳化剂和助表面活性剂溶解于非矿物油中，混匀，得中间油相；3)将内部水相缓慢加入到中间油相中，600～1200rpm的转速下自乳化，得稳定的油包水初乳；4)将亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂加入到生理盐水中，磁力搅拌充分混匀，得外部水相；5)将油包水初乳加入到外部水相中，8000～12000rpm的剪切速度下乳化，得到由内部水相、中间油相以及外部水相组成的多重纳米乳疫苗佐剂。2.如权利要求1所述的多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，得到的多重纳米乳疫苗佐剂中，内部水相中的各组分，按多重纳米乳疫苗佐剂的总重量计，为：免疫增强剂0.5～2.5％；中间油相中的各组分，按多重纳米乳疫苗佐剂的总重量计，为：乳化剂0.8～1.4％、助表面活性剂0.8～1.4％、非矿物油5.2～6.4％；外部水相中各组分，按多重纳米乳疫苗佐剂的总重量计，为：亲水性表面活性剂2.7～4.2％、亲油性表面活...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春维，陶冶，程铭，焦文杰，夏廉臣，王雪晖，祝爱侠，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42