一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法技术

本发明专利技术公开一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，取微量组织样本于预先加入预冻的甲醇‑水溶液中，经低温珠撞匀浆后，离心取上清液用于代谢组学研究，组织残渣加入预冻叔丁基甲醚，再次匀浆离心后用于脂质组学研究。本发明专利技术通过微量的组织能实现亲水和亲脂性内源性代谢物的同时提取，分别用于代谢组学和脂质组学研究，与文献报道方法相比，通过两步分别提取，避免了混合溶剂一步提取再通过两相分离实现亲水和亲脂代谢物提取过程中单一提取体系难以实现脂质全谱覆盖，以及部分亲水性的代谢物在相分离过程中部分分配到脂质提取层的技术问题，同时采用MTBE提取具有比二氯甲烷‑甲醇更高的脂质提取效率和更便利的实验操作性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法
本专利技术涉及分析化学
，具体地说，是一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法。
技术介绍
组织样本，特别是微量病例样本和小动物的组织样本在进行包括生化指标、免疫、组织切片、基因和蛋白以及组学分析时，常遇到样品的量不足以进行如此多的测试分析，这就需要建立一些高通量适合同一样本能够同时获得多个检测参数的分析方法。代谢组学和脂质组学作为系统生物学研究的方法，这两种组学能获得相互关联的代谢指标，同一样本同时用于两组学的研究，可以避免取两份样品分别用于两组学研究所带来的由于取样位置的差异而影响两组学数据的关联性和一致性；同时两组学合并进行样品前处理，不仅节约了人力、物力和成本，更重要的是节约了时间，提高了样品前处理的通量性。甲醇(MeOH)-水和甲基叔丁基醚(MTBE)体系已广泛地分别应用到组织样本亲水性和亲脂性代谢物的提取。专利文献CN103776911A采用MeOH-H2O-MTBE同时提取冷冻干燥组织样本中的亲水性和亲脂性的样本，然后通过补加H2O实现水相和MTBE相分离，分别获得亲水性(水相中)和亲脂性(MTBE中)代谢物的提取，由于采用混合溶剂体系，其极性单一，难以覆盖高极性和低极性的代谢物，另外在相分离时，由于MTBE极性稍大，会有一部分极性偏小的亲水性代谢物分配到MTBE层，而这一部分代谢物在反向色谱(RPC)分离时，由于极性较大有可能出现色谱不保留或者色谱峰性差等问题。氯代烷烃—H2O是脂质组学提取的重要溶剂体系，也有研究报道依次分别采用甲醇(MeOH)-H2O和二氯甲烷(DCM)-MeOH体系提取组织样本中亲水性和亲脂性代谢物，但在采用MeOH-H2O进行提取时，该提取体系会影响脂质代谢物的聚集，可能使它们形成亲水性部分朝外而亲脂性部位朝内的胶束，H2O会以氢键的形式与脂质分子作用而在胶束外层形成水膜，当采用DCM-MeOH脂质提取时，由于该体系水溶性很差而不能突破水膜及其脂质胶束外层，则不能有效地溶解脂质分子实现脂质提取。同时DCM作为氯代试剂具有高毒性外，还由于DCM的高密度特性，提取完毕经离心后提取溶液(DCM溶液)在下层而组织残渣在上层，严重影响提取溶液与组织残渣的分离以及提取溶液的转移。因此针对现有技术的缺点，特别是类似技术方法的不足，有必要提供一种提取效率更高，稳定性好的提取方法，用于组织样本代谢组学和脂质组学研究，使亲水性和亲脂性代谢物在两种提取体系中实现较好地分配，避免部分亲水性的代谢物在相分离过程中部分分配到脂质提取层所带来的色谱分离问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种微量组织样品亲水性和亲脂性代谢物两步连续提取的新方法，相比传统采用两份样品完成亲水性和亲脂性代谢物提取方法具有消耗样品小，高通量，不仅节约人力、物力和财力，更节省了时间，与文献报道类似方法相比，该方法提取效率更高，稳定性好，亲水性和亲脂性代谢物在两种提取体系中实现较好地分配，避免部分亲水性的代谢物在相分离过程中部分分配到脂质提取层所带来的色谱分离问题。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，先后采用预冻的甲醇(MeOH)-水和叔丁基甲醚(MTBE)溶剂体系分两步对组织样本进行提取，获得亲水性和亲脂性提取物，亲水性提取物采用亲水性作用色谱高分辨质谱(HILIC-HRMS)分析用于代谢组学研究，亲脂性提取物采用反向色谱高分辨质谱(RPC-HRMS)分析用于脂质组学研究。作为本专利技术的一个优选实施方案，分别采用两个提取体系：预冻MeOH-水和预冻MTBE，预冻MeOH-水用于亲水性代谢物提取，预冻MTBE用于亲脂性代谢物提取；先进行亲水性代谢物的提取，待移除提取溶液后，其提取组织残渣用于亲脂性代谢物的提取；所述亲水性代谢物提取中MeOH与水的体积比为0.1-10:1。作为本专利技术的一个优选实施方案，整个操作保持低温，所述低温是指≤4℃。作为本专利技术的一个优选实施方案，所述亲水性代谢物提取中MeOH与水的体积比为1:1。作为本专利技术的一个优选实施方案，所述组织样本为离体生物组织，提取的样本类型包括所有动物和人组织样本，同一份实验样品用于亲水性和亲脂性代谢物的提取。例如，该生物组织可以是肝组织、肾上腺组织、阑尾组织、膀胱组织、肠道组织、脑组织、乳腺组织、支气管、冠状组织、耳组织、食管组织、眼组织、胆囊组织、生殖器组织、心脏组织、下丘脑组织、肾组织、大肠组织、肠组织、喉组织、肺组织、淋巴结、口腔组织、鼻组织、胰腺组织、甲状旁腺组织、垂体组织、前列腺组织、直肠组织、唾液腺组织、骨骼肌组织、皮肤组织等等。作为本专利技术的一个优选实施方案，采用新鲜冷冻组织进行提取。作为本专利技术的一个优选实施方案，提取方法包括：取微量组织样本于预冻的甲醇(MeOH)-水溶液中，经低温珠撞匀浆后，离心取上清液用于代谢组学研究，提取后的组织残渣加入预冻叔丁基甲醚(MTBE)，再次匀浆离心后用于脂质组学研究。作为本专利技术的一个优选实施方案，提取方法具体如下：A)取新鲜组织或解冻组织样品200-300mg于具塞离心管；B)按照每28mg组织样本加入100μL的溶剂比例加入适当体积的亲水性代谢物提取溶液冻MeOH-水(1/1，v/v)，然后在离心管中加入事先分别用MeOH和MTBE超声波清洗过的钢珠，密封后置于干冰30s，取出后立即置于全自动样品快速研磨仪中研磨2次，研磨频率为60Hz，研磨时间为20s；C)研磨完毕，立即取出样品在13,000rpm转速下低温(4℃)离心20min，离心完毕，准确移取50μL上清液于全回收的进样瓶中，置于离心旋转蒸发器中浓缩之干，作为亲水性部分提取物；D)待取完亲水性样品提取液，立即将离心管中剩余的溶液彻底移除，移除后，在剩余的组织残渣中加入与亲水性代谢物提取溶液体积相同的脂质代谢物提取溶液，研磨完毕按照亲水性代谢物提取的方法进行样品离心、50μL样品转移和浓缩，作为脂质部分提取物。E)在上述亲水性提取物和脂质类提取物中分别加入250μL预先冷冻(4℃)的95％乙腈(ACN)和水-ACN-异丙醇(ISP)(1/1/2，v/v/v)，剧烈震荡30s，超声波辅助复溶1min，在13,000rpm条件下低温(4℃)离心20min，取上清液过0.22μm的过滤膜，分别作为亲水性和脂质类代谢物进样分析样品，置于-20℃待上机检测分析。F)亲水性样品采用HILIC-HRMS进行数据采集，亲脂性样品采用RPC-HRMS进行数据采集。仪器分析的进样顺序、相关的质控和评价与第三部分相同，针对每一批样品，上样顺序依次为溶剂空白、过程空白、QC样品、12个样品、QC样品、12个样品……QC样品、QC稀释样品和溶剂空白，样品以随机生成的顺序进行进样。MetID样品穿插于这些样品中，采用全MS扫描+DDMS2采集数据。整批数据的质量评价主要基于对溶剂空白、过程空白、QC和稀释QC等样品的数据分析。G)样品采集的数据采用组学数据处理和分析软件进行包括特征提取、样品峰对齐、原始数据数据导出、原始数据过滤以及标准化等处理、组学多元统计分析以及代谢物质谱鉴定。本专利技术与现有类似同时实现组织样本亲水和亲脂代谢物提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，其特征在于，先后采用预冻的甲醇‑水和叔丁基甲醚溶剂体系，分两步对组织样本进行提取，获得亲水性提取物和亲脂性提取物，亲水性提取物采用亲水性作用色谱高分辨质谱分析用于代谢组学研究，亲脂性提取物采用反向色谱高分辨质谱分析用于脂质组学研究。

【技术特征摘要】
1.一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，其特征在于，先后采用预冻的甲醇-水和叔丁基甲醚溶剂体系，分两步对组织样本进行提取，获得亲水性提取物和亲脂性提取物，亲水性提取物采用亲水性作用色谱高分辨质谱分析用于代谢组学研究，亲脂性提取物采用反向色谱高分辨质谱分析用于脂质组学研究。2.根据权利要求1所述用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，其特征在于，分别包括两个提取体系：预冻MeOH-水和预冻MTBE，预冻MeOH-水用于亲水性代谢物提取，预冻MTBE用于亲脂性代谢物提取；先进行亲水性代谢物的提取，待移除提取溶液后，其提取组织残渣用于亲脂性代谢物的提取；所述亲水性代谢物提取中MeOH与水的体积比为0.1-10:1。3.根据权利要求1所述用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，其特征在于，整个操作保持低温，所述低温是指≤4℃。4.根据权利要求2所述用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，其特征在于，所述亲水性代谢物提取中MeOH与水的体积比为1:1。5.根据权利要求1所述用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，其特征在于，所述组织样本为离体生物组织，提取的样本类型包括所有动物和人组织样本，同一份实验样品用于亲水性和亲脂性代谢物的提取。6.根据权利要求1所述用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢大胜，汪国权，周志俊，薛黎明，冯超，金玉娥，邱歆磊，林元杰，徐骞，乐孙阳，
申请(专利权)人：上海市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：上海,31