本发明专利技术公开了一种厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用，编码该木聚糖酶的DNA序列选自：a）含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA序列，或b）编码SEQ ID NO.2所示蛋白序列的DNA序列，或c）在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或d）由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或e）a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链；以该序列构建出了表达载体和重组宿主菌；从重组菌种分离得到厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶。该抗抑制性木聚糖酶对XIP‑I拥有强烈抗性，能在抑制蛋白和面粉加工领域中广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。
技术介绍
木聚糖是半纤维素的重要组分，其主要存在于植物细胞壁的次生壁中，约占细胞干重的35%，是除纤维素外自然界中最丰富的可再生资源。木聚糖由D-木糖残基通过β-1,4-糖苷键连接而成，主侧链上包含多种取代基，因此木聚糖结构比较复杂且结构差异较大。木聚糖的降解过程是由木聚糖酶系协同作用的结果，β-木糖苷酶主要作用于木聚糖降解过程中寡聚糖的降解。α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖脂酶和酚酸脂酶等主要负责降解木聚糖支链。然而，β-1,4-内切木聚糖酶能够切割木糖分子之间的β-1,4-糖苷键产生木寡糖，在木聚糖的降解过程中起着重要的作用。木聚糖酶的来源相当广泛，已发现的能产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、青霉、木霉、曲霉等。目前人们广泛研究和应用的是细菌、木霉和曲霉产木聚糖酶。依据木聚糖酶催化结构域氨基酸序列的同源性以及疏水簇的分析，将其划分为糖苷水解酶第10家族和第11家族。这两个家族的酶在结构、等电点、水解速率、底物特异等方面均存在着较大的差异。GH10家族木聚糖酶主要由α-螺旋与β-折叠组成，呈现“salad”碗状，其底物结合缝隙位于碗状结构的中间。GH10家族木聚糖酶降解木聚糖的速率较快，并且能够降解纤维寡糖及其衍生物。GH11家族木聚糖酶通常由1个α-螺旋与多个β-折叠组成，整体呈现出右手半握状的形态，可细分为“手指”、“手掌”、“thumb”等结构域。GH11家族木聚糖酶水解木聚糖的速率相对较慢，但对底物有较高的特异性，被称作是真正的木聚糖酶。木聚糖酶的应用一直为研究者所关注，木聚糖酶在食品、饲料、造纸、生物转化等领域已经有了广泛的应用。其中，木聚糖酶在饲料工业中的应用较为广泛，它能显著地提高对木质纤维素物质的利用。麸皮、小麦等大多作为饲料的原料，其中含有大量的非淀粉类多糖，不能被非反刍动物消化吸收，反而加大消化道中的食糜体积，增加粘度，抑制营养物质的释放，影响饲料的利用率。在饲料中适当的加入木聚糖酶等酶制剂，能够降解可溶性多糖，降低食糜黏度，增强动物对营养物质吸收的能力，从而提高饲料的利用率，提高动物的生产性能。近年的研究发现，在小麦等谷物中存在能够抑制木聚糖酶活性的木聚糖酶抑制蛋白。由于木聚糖酶抑制蛋白存在的普遍性与持久性，因此那些需要外加木聚糖酶而进行的动物饲料配制或谷物加工过程等，其中的木聚糖酶的作用效果会受到木聚糖酶抑制蛋白的影响，从而影响饲料质量或加工效果。面包烤制过程中，小麦中抑制蛋白的存在会抵消木聚糖酶增大面包体积的效果；谷朊粉-淀粉分离过程中，抑制蛋白会降低谷朊粉和淀粉的分离效率；动物饲料配制方面，谷物中抑制蛋白的存在会降低木聚糖酶降解木聚糖的效果，从而限制了饲料利用率及动物生产效率。迄今为止，已经发现了三种不同类型的木聚糖酶抑制蛋白TAXI、XIP和TLXI。RuthFlatman等发现TAXI、TLXI能够专一性地作用于GH11家族木聚糖酶；XIP则能够同时抑制真菌来源的GH10和GH11家族木聚糖酶。三型抑制蛋白中，XIP的含量是最高的，并且真菌木聚糖酶相较于细菌木聚糖酶拥有诸多优点。因此，亟需选育出对XIP抑制蛋白具有抗性的木聚糖酶，以便在木聚糖酶的应用领域上提高酶的作用效率，从而降低经济成本。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种对XIP抑制蛋白具有强烈抗性的厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术思路：专利技术人前期进行了大量的筛选研究，最终筛选到一种来自于Piromycessp.RRY-2002的木聚糖酶，并将该木聚糖酶从Piromycessp.RRY-2002中分离并分析其氨基酸序列后，再以其为基础进行了基因密码子优化，得到如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；然后进一步将该核苷酸序列转入E.coliBL21中表达，得到对XIP-I型抑制蛋白具有强烈抗性的木聚糖酶，并更进一步深入研究掌握了该酶的最适温度、最适pH、酸性稳定性、温度稳定性等特性。具体技术方案如下：设计编码一种厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶，所述DNA序列选自：a）：含有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的DNA序列，或b）：编码SEQIDNO.2所示氨基酸序列的DNA序列，或c）：在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或d）：由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或e）：a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链。进一步的可构建一种含上述DNA序列表达载体。还可进一步的利用上述表达载体转化得到一种重组宿主菌。进一步转化，可得到一种厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶，其分子量为27kDa，其对XIP-I型抑制蛋白具有抗性。上述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：（1）构建所述核酸序列的重组表达载体；（2）将重组表达载体导入宿主菌构建重组宿主菌；（3）发酵培养重组宿主菌后，离心收集菌体；（4）破碎菌体，高速离心后收集上清液，得粗酶液；（5）利用亲和层析纯化粗酶后，得抗抑制性木聚糖酶。将所述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶在抗XIP-I型抑制蛋白中应用。优选的，所述木聚糖酶的反应温度为40℃～70℃。优选的，所述木聚糖酶的反应pH为3.0～7.0。优选的，所述木聚糖酶在40℃下的半失活时间为25min。将所述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶在面粉加工领域中应用。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果在于：1.专利技术人发现本专利技术的木聚糖酶与其它来源的GH11家族木聚糖酶的氨基酸序列比对，在其的“thumb”结构区域存在明显差异，并且在其G171后有额外的一个氨基酸的插入，与XIP-I形成空间上的对抗，导致其不受XIP-I的抑制。2.本专利技术的木聚糖酶的酶反应温度范围广，酶活性高，酸性环境下仍能长时间保持较高相对活力。3.本专利技术的木聚糖酶长时间内拥有较高的温度稳定性，对XIP-I拥有强烈抗性。4.本专利技术的木聚糖酶在谷朊粉-淀粉分离过程中，可通过降低温度以营造出利于木聚糖酶反应的环境，进而提高的谷朊粉-淀粉分离转化效率。附图说明图1为重组蛋白SDS-PAGE电泳图；其中，M为M221marker，1～3为咪唑浓度100mM，4～8为咪唑浓度150mM，9～13咪唑浓度200mM，14为pET-20b；图2为重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图；其中，M为M221marker，1为pET-20b，2为重组蛋白；图3为温度对抗性木聚糖酶活力的影响图；图4为pH对抗性木聚糖酶活力的影响图；图5为在40℃环境下酶的稳定性曲线图；图6为在pH3.0、4℃环境下酶的稳定性曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例一：试剂和溶液1.LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种编码厌氧真菌来源的抗抑制性木聚糖酶核酸序列，其DNA序列选自：a）：含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA序列，或b）：编码SEQ ID NO.2所示蛋白序列的DNA序列，或c）：在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或d）：由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或e）：a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链。
【技术特征摘要】
1.一种编码厌氧真菌来源的抗抑制性木聚糖酶核酸序列，其DNA序列选自：a）：含有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的DNA序列，或b）：编码SEQIDNO.2所示蛋白序列的DNA序列，或c）：在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或d）：由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或e）：a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链。2.一种含权利要求1所述DNA序列的表达载体。3.一种由权利要求2所述表达载体转化而得的重组宿主菌。4.一种由权利要求1所述核酸序列编码、权利要求2所述表达载体表达或权利要求3所述重组宿主菌分离的厌氧真菌来源的抗抑制性木聚糖酶。5.权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈红歌，刘新育，谢夏，翟嘉奇，刘思奇，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。