一种用于制备上皮细胞片的培养装置及其应用制造方法及图纸

本发明专利技术涉及组织工程口腔黏膜上皮细胞片的制备方法。具体地，本发明专利技术提供一种口腔黏膜上皮细胞片的制备方法，包括以下步骤：(a)口腔黏膜组织采集步骤；(b)口腔黏膜上皮细胞提取步骤；(c)口腔黏膜成纤维细胞提取步骤；(d)上皮细胞培养基质和培养支架制备步骤；(e)口腔黏膜上皮细胞与口腔黏膜成纤维细胞共培养步骤；以及(f)制备得到的上皮细胞片与同培养材料的分离步骤。

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备上皮细胞片的培养装置及其应用
本专利技术涉及组织工程与生物制品领域，具体地，本专利技术涉及一种用于角膜疾病(尤其是角膜眼表疾病)治疗的上皮细胞片的制备方法及其应用。
技术介绍
人的眼角膜共分5层，由前向后依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。上皮细胞层是最外面的一层，厚度约为50微米，占整个角膜厚度的10％，由5-6层细胞所组成。角膜周边部上皮增厚，细胞层数增加到8-10层。角膜上皮共有3种类型的细胞：基底细胞、翼状细胞、扁平细胞。上皮细胞间以桥小体相接，构成致密的质膜，这层致密坚固的屏障可阻止大部分微生物的侵入，阻止泪液中液体和电解质进入基质层，使得角膜处于相对脱水状态。由于外界原因和/或自身原因角膜上皮层会发生各种损伤和/或病变，情况严重导致失明。化学伤、热灼伤或其他疾病(例如，Steven-Johnson、眼天疱疮等)可导致眼表损伤，破坏角膜上皮的结构和功能。目前，目前临床治疗主要依赖于异体角膜移植，但供体材料来源有限等困难严重制约了这一治疗方法的应用。而且，异体角膜移植仍然存在术后免疫反应，甚至出现供体排斥而致手术失败。此外，现有治疗方法还包括人工角膜移植。目前，已有多种人工角膜应用于临床，但其材料均达不到理想要求。而且，由于人工角膜的晚期并发症：角膜溶解、植入物排出、房水渗漏、眼内炎、人工角膜后增生膜、青光眼等，目前仅适用于常规角膜移植失败的双眼角膜混浊性失明患者，一般只作为最后的选择。还可采用的另一种治疗方法是：羊膜移植。人羊膜可作为基底膜、促进上皮细胞增殖和分化以及抗炎症抗粘连等用于眼表疾病的治疗，但羊膜是来源于异体组织，难免会带来供体的相关物质，其安全性值得考虑。最近新起的一种治疗方法是：生物角膜移植，生物角膜虽然可以解决供体紧张及人工角膜缺陷的一些问题，但其来源是异种属，难以避免排异反应，其安全性值得考虑。随着组织特异性干细胞知识的不断深入以及组织工程技术的飞速发展，自体角膜缘干细胞体外培养形成细胞片，用于眼表损伤的重建取得令人满意的临床效果。但是对于双眼眼表损伤的患者，因没有健康的角膜缘组织可供取材，故无法开展。因此，本领域迫切需要一种更佳的角膜损伤治疗方法，既能解决供体不足的问题，同时也能避免异体移植可能发生的排斥反应以及长时间使用糖皮质激素和免疫抑制剂带来的一系列不良反应，从而为LSCD患者提供了个体化可行性治疗方案。
技术实现思路
在本专利技术的一方面，提供了一种用于制备上皮细胞片的培养装置，所述培养装置包括：a)细胞培养板，所述细胞培养板包含培养基；b)位于所述细胞培养板内的培养小室，所述培养小室包含培养基；c)位于所述培养小室底部的培养支架，所述培养支架为O型圈；d)位于所述培养支架上的培养基质，所述培养基质包含凝血酶和纤维蛋白原。在本专利技术优选的实施方式中，所述细胞培养板与所述培养小室中包含的培养基是相同的。在本专利技术优选的实施方式中，所述细胞培养板采用的培养基是包含表皮生长因子、胰岛素、Rock抑制剂的DMEM/F12培养基。在一个具体的实施方式中，采用的培养基是包含20纳克/毫升的重组人表皮生长因子、10微克/毫升重组人胰岛素、10微摩尔的Rock抑制剂Y-27632的DMEM/F12培养基。在本专利技术优选的实施方式中，所述培养小室采用的培养基是包含表皮生长因子、胰岛素、Rock抑制剂的DMEM/F12培养基。在一个具体的实施方式中，采用的培养基是包含20纳克/毫升的重组人表皮生长因子、10微克/毫升重组人胰岛素、10微摩尔的Rock抑制剂Y-27632的DMEM/F12培养基。在本专利技术优选的实施方式中，所述培养基质采用包含表皮生长因子、胰岛素、Rock抑制剂的DMEM/F12的培养基进行配制。在一个具体的实施方式中，采用的培养基是包含20纳克/毫升的重组人表皮生长因子、10微克/毫升重组人胰岛素、10微摩尔的Rock抑制剂Y-27632的DMEM/F12培养基。在本专利技术优选的实施方式中，所述培养支架是外径约为23毫米、内径约为18毫米的O型圈。在一些实施方式中，本专利技术采用的培养基支架的外经为20-28毫米。在一些实施方式中，本专利技术采用的培养支架的内径为15-20毫米。在本专利技术优选的实施方式中，所述培养支架采用的材料是医学上可接受的聚合物材料。在一个具体的实施方式中，所述培养支架具有0.4μm孔径和10μm厚度。在本专利技术优选的实施方式中，所述培养基质包含1IU/ml的凝血酶以及1-1.6mg/ml的纤维蛋白原。在本专利技术的另一方面，提供了所述培养装置的应用，用于制备上皮细胞片。附图说明图1显示了口腔上皮细胞片的制备工艺流程。图2显示了口腔黏膜上皮细胞与口腔黏膜成纤维细胞共培养中使用的细胞培养支架的一个实施方式。图3显示了培养的口腔黏膜上皮细胞片组织学切片HE染色结果。图4A-4C分别显示了第2天、第4天和第6天观察到成纤维细胞的显微镜图片(放大倍数4x)。图5A和5B分别显示了经丝裂霉素C处理的成纤维细胞在显微镜下的形态以及培养24小时后可以作为饲养细胞与口腔上皮细胞共培养的成纤维细胞的形态。图6显示上皮细胞融合达到80％的结果。图7显示细胞融合达到100％的结果。图8A-8B显示p63蛋白和K3蛋白有明显表达阳性的图片。其中，图8A-1显示细胞核，图8A-2显示K3+，图8B-1显示细胞核，图8B-2显示p63+。具体实施方式专利技术人经过广泛而深入的研究，发现利用组织工程共培养获得的自体口腔黏膜上皮细胞片能够用于角膜移植，具有良好的修复效果。本专利技术用自体口腔成纤维细胞为共培养的饲养细胞，代替了国际普遍使用的鼠源饲养细胞，使培养后的口腔黏膜上皮片更安全，并解决了细胞培养共培养中的所用动物来源饲养细胞难题。上皮细胞通过自体口腔上皮细胞-自体口腔成纤维细胞共培养经过上皮细胞原代扩增培养、上皮细胞继代增殖分化培养所制造的细胞片为多种形态上皮细胞的复层细胞结构，其中包含表达干细胞特性P63蛋白的上皮基质细胞、K3蛋白特性的分化的上皮角质细胞。自体口腔黏膜上皮细胞片组织为复层细胞片，包括角质细胞层，基质细胞层，因此具有增殖和分化功能。本专利技术所述方法制备的细胞片的特点是，上皮细胞和共培养的成纤维细胞来源均来自于患者自体，用于组织工程产品临床治疗减少排斥反应，大大提高术后恢复效果。成纤维细胞成纤维细胞提取用经Ⅰ型中性蛋白酶消化后的结缔组织块贴附培养法培养提取，成纤维细胞培养使用基础培养基为DMEM(HycloneCat：SH30243.01B)。成纤维细胞作为共培养饲养细胞处理。利用丝裂霉素C对DNA增殖和聚合有抑制作用，阻断成纤维细胞增殖从而分泌表达大量蛋白类生长因子为共培养的上皮细胞提供营养。尽管自体的成纤维细胞是优选的，但异体的成纤维细胞的来源也可使用。培养支架本专利技术的培养支架采用O型圈状结构，构成支架的材料是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。当然，本专利技术的培养支架也可以采用其他采用材料制成。可用于制备本专利技术的培养支架的材料是医学上可接受的聚合物材料，包括(但并不限于)：(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备上皮细胞片的培养装置，所述培养装置包括：a)细胞培养板，所述细胞培养板包含培养基；b)位于所述细胞培养板内的培养小室，所述培养小室包含培养基；c)位于所述培养小室底部的培养支架，所述培养支架为O型圈；d)位于所述培养支架上的培养基质，所述培养基质包含凝血酶和纤维蛋白原。

【技术特征摘要】
1.一种用于制备上皮细胞片的培养装置，所述培养装置包括：a)细胞培养板，所述细胞培养板包含培养基；b)位于所述细胞培养板内的培养小室，所述培养小室包含培养基；c)位于所述培养小室底部的培养支架，所述培养支架为O型圈；d)位于所述培养支架上的培养基质，所述培养基质包含凝血酶和纤维蛋白原。2.如权利要求1所述的培养装置，其特征在于，所述细胞培养板与所述培养小室中包含的培养基是相同的。3.如权利要求1所述的培养装置，其特征在于，所述细胞培养板采用的培养基是包含表皮生长因子、胰岛素、Rock抑制剂的DMEM/F12培养基。4.如权利要求1所述的培养装置，其特征在于，所述培养小室采用的培养基是包含表皮生长因子、胰岛素、Rock抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛琦，石躍由佳，吴复跃，何振东，
申请(专利权)人：上海睿泰生物科技股份有限公司，合肥欣睿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31