一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca制造技术

本发明专利技术公开一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，是以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+；本发明专利技术方法能实现对多目标离子的检测，本发明专利技术中的探针与Ca2+、Sr2+和Ba2+在细胞内分别形成探针‑Ca2+、探针‑Sr2+、探针‑Ba2+配合物，发射不同波长强烈荧光，检测方便，可视性好，灵敏度高、选择性好，能实现实时在线检测细胞内Ca2+、Sr2+和Ba2+。

Single channel fluorescence imaging for detection of trace Ca in active cancer cells

The invention discloses a method for detecting trace Ca 2+, Sr 2+ and Ba 2+ in active cancer cells by single channel fluorescence imaging, in which the classical calix [4] arene derivatives are used as probes and the trace Ca 2+, Sr 2+ and Ba 2+ in active cancer cells are detected by single channel fluorescence imaging, respectively. The method can realize the detection of multi-target ions. The probes and Ca2+, Sr2+ and Ba2+ formed probe Ca2+, probe Sr2+, probe

【技术实现步骤摘要】
一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法
本专利技术涉及一种单通道荧光成像检测活细胞中微量离子的方法，特别是一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法。
技术介绍
在细胞生物学和医学研究中，荧光探针因其高空间分辨能力和最小限度扰动活体的特征，能够允许研究者实时监测到发生于活细胞及生物活体中的事件，作为最强有力的工具之一，被越来越重视和使用。探针作为研究金属离子传输载体以及在药物传输系统中细胞膜的跨越行为尤为重要。荧光成像检测细胞内离子能够提供生命体系中离子的时空分布最直接的信息，由于它的无创性、高灵敏、高选择等特征，在生物体系中是追踪金属离子最可靠的技术之一。钙、锶、钡均为周期表中IIA族碱土金属，是地壳中含量较多的元素，它们在生物学的功能中有着同样重要作用，参与各种生理功能和代谢过程，影响器官组织的活动。其中，钙是人体中含量最丰富且必须的营养元素，也是人体中最常见的一种矿物质离子。钙对身体中骨骼和对软组织发育过程中如骨盐沉积、血凝固、肌肉收缩、神经刺激管理和细胞生长及变异都及其重要。反常高或低的血浆水平中的钙被认为是高或低钙血症。钙信号的异常会导致神经退行性变，心脏病，骨骼肌缺陷以及中枢神经紊乱等。因此，检测细胞及血浆中微量钙是非常必要的。虽然，锶在生理学中的相关性不如Ca2+那样密切，但由于存在于某些合金、染料及铁氧磁体和荧光灯中等商业用途，特别是具有放射性的Sr2+的高灵敏和快速及实时检测能够有助环境安全及决策。钡及其化合物用途甚广，常见钡盐有硫酸钡、碳酸钡、氯化钡硫化钡、硝酸钡、氧化钡等，除硫酸钡外，其他钡盐均有毒性，存在着钡中毒的可能。钡广泛用于颜料、玻璃及烟花制品等许多行业，为其进入环境提供了途径。Ba2+在生物系统中同样起着重要作用。人体中Ba2+水平增高会导致急性胃肠炎，肌肉麻痹，呼吸衰竭等。因此，对于钙、锶、钡离子的检测十分重要作为细胞成像检测微量金属离子的探针已有很多报道，但大多是单探针对单一目标离子检测，存在检测不方便，选择性差，不能实现单一探针对细胞中多目标离子的高效检测等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，本专利技术方法能实现对多目标离子的检测，本专利技术中的探针与Ca2+、Sr2+和Ba2+在细胞内分别形成探针-Ca2+、探针-Sr2+、探针-Ba2+配合物，使探针原本的荧光猝灭，检测方便，可视性好，灵敏度高、选择性好，能实现实时在线检测细胞内Ca2+、Sr2+和Ba2+。本专利技术的技术方案：一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，是以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+；所述的探针的化学结构式为：前述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，所述的以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+是；是用探针和Ca2+、Sr2+、Ba2+分别对活细胞进行孵化，使探针和Ca2+、Sr2+、Ba2+先后分别进入细胞内，在细胞内结合生成探针-Ca2+、Sr2+、Ba2+配合物导致探针发出的荧光猝灭，用荧光倒置显微镜观测孵化后的活细胞荧光像，具体方法为：(1)活性Hela细胞经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗RPMI1640的培养基中，在温度为37℃，5％CO2及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×104个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次；所述的RPMI为英文RoswellParkMemorialInstitute的缩写，代指洛斯维·帕克纪念研究所，RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号；(2)将步骤(1)中清洗后的Hela细胞浸入含25μM探针的培养液中，培养液的组成为98％培养基和2％N,N-二甲基甲酰胺，置于含5％CO2的37℃恒温培养箱内孵育90min，吸出含探针的培养液，用新鲜的RPMIMediumModified培养基清洗细胞三次，置于荧光倒置显微镜下分别进行场亮场和暗场拍照；荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探染色后细胞的荧光图像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm，细胞呈现的绿色荧光，拍摄得到清晰的绿色荧光细胞轮廓影像；(3)在上述(2)中细胞孔板内再分别加入0.5mL含60μMCa2+、Sr2+、Ba2+溶液的培养液，培养液的组成为98％培养基和2％H2O，在恒温培养箱内孵育40min，进行细胞内探针对Ca2+、Sr2+、Ba2+染色，吸出含Ca2+、Sr2+、Ba2+溶液的培养液，用新鲜的RPMIMediumModified培养基洗三次，置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Ca2+、Sr2+、Ba2+染色后的荧光像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm，细胞的绿色荧光猝灭，表明探针能在活性Hale细胞中检测微量Ca2+、Sr2+、Ba2+离子。前述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，所用活体Hale细胞是人体宫颈癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。前述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，所述的探针；是按下述合成路线合成的：前述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，所述的探针；是按下述步骤进行制备：①中间体1的制备：取对叔丁基苯酚，加入1000ml的三口圆底烧瓶中，然后按照对叔丁基苯酚:氢氧化钠:37％甲醛水溶液为0.67mol:33.75mmol:80ml的比例依次向对叔丁基苯酚中加入氢氧化钠以及37％甲醛水溶液，在氮气流下吹出90％以上的水，加热到110-120℃，机械搅拌1.5-2.5h后，停止反应，冷却至室温，按37％甲醛水溶液与二苯醚为80:500的体积比向其中倒入85℃的二苯醚，并继续搅拌，将烧瓶中的混合物加热回流，反应2.5-3.5h后，停止反应，冷却至室温，按二苯醚与乙酸乙酯为500:2000的体积比向烧瓶中加入乙酸乙酯，搅拌至白色沉淀析出，静置，抽滤，并依次用乙酸乙酯、乙酸和蒸馏水洗涤3次，干燥，即得白色粉末中间体1；②中间体2的制备：中间体1放入250ml圆底烧瓶中，按中间体1:甲苯:苯酚:无水AlCl3为30.87mmol:150ml:154.3mmol:185.2mmol的比例依次向圆底烧瓶中加入甲苯:苯酚:无水AlCl3，氮气保护下室温搅拌，反应3.5-4.5h后，将反应液倒入1M盐酸水溶液中，依次用盐酸溶液和水洗涤，分液，并蒸发掉溶剂，按甲苯与甲醇为1:1的体积比向所得固体中加入甲醇回流25-35min，冷却抽滤，得到中间体2；③中间体3的制备：乙腈加入三口烧瓶中，按乙腈:中间体2:K2CO3为150ml:11.8mmol:12.92mmol的比例向装有乙腈的三口烧瓶中依次加入中间体2和K2CO3，搅拌加热回流25-35min后，按乙腈:溴乙酸乙酯为150:6的体积比向烧瓶中加入溴乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，其特征在于：是以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+；所述的探针的化学结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，其特征在于：是以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+；所述的探针的化学结构式为：2.如权利要求1所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，其特征在于：所述的以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+是；是用探针和Ca2+、Sr2+、Ba2+分别对活细胞进行孵化，使探针和Ca2+、Sr2+、Ba2+先后分别进入细胞内，在细胞内结合生成探针-Ca2+、Sr2+、Ba2+配合物导致探针发出的荧光猝灭，用荧光倒置显微镜观测孵化后的活细胞荧光像，具体方法为：(1)活性Hela细胞经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗RPMI1640的培养基中，在温度为37℃，5％CO2及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×104个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次；(2)将步骤(1)中清洗后的Hela细胞浸入含25μM探针的培养液中，培养液的组成为98％培养基和2％N,N-二甲基甲酰胺，置于含5％CO2的37℃恒温培养箱内孵育90min，吸出含探针的培养液，用新鲜的RPMIMediumModified培养基清洗细胞三次，置于荧光倒置显微镜下分别进行场亮场和暗场拍照；荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探染色后细胞的荧光图像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm，细胞呈现的绿色荧光，拍摄得到清晰的绿色荧光细胞轮廓影像；(3)在上述(2)中细胞孔板内再分别加入0.5mL含60μMCa2+、Sr2+、Ba2+溶液的培养液，培养液的组成为98％培养基和2％H2O，在恒温培养箱内孵育40min，进行细胞内探针对Ca2+、Sr2+、Ba2+染色，吸出含Ca2+、Sr2+、Ba2+溶液的培养液，用新鲜的RPMIMediumModified培养基洗三次，置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Ca2+、Sr2+、Ba2+染色后的荧光像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm，细胞的绿色荧光猝灭，表明探针能在活性Hale细胞中检测微量Ca2+、Sr2+、Ba2+离子。3.如权利要求2所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，其特征在于：所用活体Hale细胞是人体宫颈癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。4.如权利要求1或2所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，其特征在于：所述的探针；是按下述合成路线合成的：5.如权利要求1或2所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法，其特征在于：所述的探针；是按下述步骤进行制备：①中间体1的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾晞，廖贤，方浚安，许万里，田雁，牟兰，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52