结合EGFR和C-MET III型纤连蛋白域的分子制造技术

本发明专利技术公开了包含EGFR和/或c‑Met FN3域的单特异性和双特异性分子、编码所述分子的分离的多核苷酸、载体、宿主细胞，以及它们的制备方法。这些包含EGFR和/或c‑Met FN3域的单特异性和双特异性分子可用于生成用于治疗和诊断包括癌症的病症和疾病的治疗组合物。

Binding of EGFR and C-MET III type fibronectin domain molecules

The present invention discloses monospecific and bispecific molecules containing EGFR and/or c_Met FN3 domains, isolated polynucleotides encoding said molecules, carriers, host cells, and their preparation methods. These monospecific and bispecific molecules containing EGFR and/or c_Met FN3 domains can be used to generate therapeutic compounds for the treatment and diagnosis of diseases and diseases including cancer.

【技术实现步骤摘要】
结合EGFR和C-METIII型纤连蛋白域的分子本申请是申请日为2013年11月21日，申请号为201380071078.6，专利技术名称为“结合EGFR和C-METIII型纤连蛋白域的分子”的专利技术专利的分案申请。
本专利技术涉及结合EGFR和/或c-Met的单特异性或双特异性分子以及制备和使用该分子的方法。
技术介绍
表皮生长因子受体(EGFR、ErbBl或HER1)是由c-erbBl原癌基因编码的170kDa跨膜糖蛋白。EGFR是受体酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生长因子受体(HER)家族的成员，所述家族包括HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。EGFR信号传导通过如下方式引发：配体结合、之后诱导构象变化、受体与其他ErbB家族成员的同源二聚化或异源二聚化，以及受体的反式自磷酸化(Ferguson等人，AnnuRevBiophys，37:353-73，2008)，这引发了信号转导级联，最终影响多种多样的细胞功能，包括细胞增殖和存活。EGFR的表达或激酶活性的增加与一系列人癌症有关，从而使EGFR成为治疗干预的有吸引力的靶标(Mendelsohn本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种分离的包含FN3域的双特异性分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)域和第二FN3域，其中所述第一FN3域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)结合于EGFR，并且所述第二FN3域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c‑Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)结合于c‑Met。

【技术特征摘要】
2012.11.21 US 61/728906;2012.11.21 US 61/728914;201.一种分离的包含FN3域的双特异性分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)域和第二FN3域，其中所述第一FN3域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)结合于EGFR，并且所述第二FN3域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)结合于c-Met。2.根据权利要求1所述的双特异性分子，其中a)当在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，所述第一FN3域以小于约2.5×10-6M的IC50值抑制在EGFR残基第1173位酪氨酸处EGF诱导的EGFR磷酸化，并且当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，所述第二FN3域以小于约1.5×10-6M的IC50值抑制在c-Met残基第1349位酪氨酸处HGF诱导的c-Met磷酸化；b)当在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，所述第一FN3域以约1.8×10-8M和约2.5×10-6M之间的IC50值抑制在EGFR残基第1173位酪氨酸处EGF诱导的EGFR磷酸化，并且当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，所述第二FN3域以约4×10-9M和约1.5×10-6M之间的IC50值抑制在c-Met残基第1349位酪氨酸处HGF诱导的c-Met磷酸化；c)所述第一FN3域以小于约1×10-8M的离解常数(KD)结合人EGFR，并且所述第二FN3域以小于约5×10-8M的KD结合人c-Met，其中所述KD利用实例3中所述的表面等离子共振来测量；或d)所述第一FN3域以约2×10-10至约1×10-8M的KD结合人EGFR，并且所述第二FN3域以约3×10-10至约5×10-8M的KD结合人c-Met，其中所述KD利用实例5中所述的表面等离子共振来测量。3.根据权利要求1或2所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子以与所述第一FN3域和所述第二FN3域的混合物对NCI-H292细胞生长的抑制的IC50值相比小至少30倍的IC50值抑制NCI-H292细胞增殖，其中用包含7.5ng/mL的HGF的10%的FBS诱导所述细胞增殖。4.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子a)当在NCI-H292细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，以小于约8×10-7M的IC50值抑制EGFR残基第1173位酪氨酸处EGF诱导的EGFR磷酸化；b)当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，以小于约8.4×10-7M的IC50值抑制在c-Met残基第1349位酪氨酸处HGF诱导的c-Met磷酸化；c)以小于约9.5×10-6M的IC50值抑制HGF诱导的NCI-H292细胞增殖，其中用包含7.5ngHGF的10%FBS诱导所述细胞增殖；d)以小于约2.0×10-8M的KD结合EGFR；或e)以小于约2.0×10-8M的KD结合c-Met，其中所述KD利用如实例3和实例5所述的表面等离子共振来测量。5.根据权利要求1-4中任一项所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域包含与SEQIDNO:27的氨基酸序列至少87%相同的氨基酸序列，并且所述第二FN3域包含与SEQIDNO:41的氨基酸序列至少83%相同的氨基酸序列。6.根据权利要求1-5中任一项所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域包含SEQIDNO:107或SEQIDNO:108的氨基酸序列，并且所述第二FN3域包含SEQIDNO:114的氨基酸序列。7.根据权利要求1-6中任一项所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域以对应于P54AR4-83v2(SEQIDNO:27)的残基D23、F27、Y28、V77和G85的一个或多个氨基酸残基结合EGFR。8.根据权利要求7所述的双特异性分子，其中所述第二FN3域以对应于P114AR7P95-A3(SEQIDNO:41)中的残基R34、F38、M72和I79的一个或多个氨基酸残基结合c-Met。9.根据权利要求1-8中任一项所述的双特异性分子，其中a)所述第一FN3域包含：i)FG环，所述FG环包含SEQIDNO:179的氨基酸序列或SEQIDNO:180的氨基酸序列；和ii)BC环，所述BC环包含SEQIDNO:181的氨基酸序列；并且b)所述第二FN3域包含：i)C链和CD环，其包含SEQIDNO:184的氨基酸序列；和ii)F链和FG环，其包含SEQIDNO:185的氨基酸序列。10.根据权利要求1-9中任一项所述的双特异性分子，其中a)所述第一FN3域包含SEQIDNO:182的氨基酸序列或SEQIDNO:183的氨基酸序列；并且b)所述第二FN3域包含SEQIDNO:186的氨基酸序列。11.根据权利要求5-10中任一项所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域和/或所述第二FN3域包含在与Tencon(SEQIDNO:1)中的位置11、14、17、37、46、73和86对应的一个或多个残基位置处的替换。12.根据权利要求11所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域包含SEQIDNO:187的氨基酸序列；并且所述第二FN3域包含SEQIDNO:188的氨基酸序列。13.根据权利要求1-12中任一项所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域包含以SEQIDNO:18-29、107-110、122-137或194-211中的一个示出的序列，并且所述第二FN3域包含以SEQIDNO:32-49、111-114或212-223中的一个示出的序列。14.根据权利要求13所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域和所述第二FN3域包含以下的氨基酸序列：a)分别SEQIDNO:27和41；b)分别SEQIDNO:27和33；c)分别SEQIDNO:107和40；d)分别SEQIDNO:107和33；e)分别SEQIDNO:107和32；f)分别SEQIDNO:107和114；g)分别SEQIDNO:108和111；h)分别SEQIDNO:108和112；i)分别SEQIDNO:108和113；j)分别SEQIDNO:108和114；k)分别SEQIDNO:109和111；l)分别SEQIDNO:109和112；m)分别SEQIDNO:109和113；n)分别SEQIDNO:109和114；o)分别SEQIDNO:110和111；p)分别SEQIDNO:110和112；q)分别SEQIDNO:110和113；或r)分别SEQIDNO:110和114。15.根据权利要求14所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域和/或所述第二FN3域包含对应于Tencon(SEQIDNO:1)中的替换L17A、N46V和E86I的一个或多个替换。16.根据权利要求1-15中任一项所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域和/或所述第二FN3域从基于SEQIDNO:1的Tencon序列而设计的文库分离。17.根据权利要求1-16中任一项所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域和所述第二FN3域通过接头偶联。18.根据权利要求17所述的双特异性分子，其中所述接头包含以SEQIDNO:78-84或SEQIDNO:224中的一个示出的氨基酸序列。19.根据权利要求1-18中任一项所述的双特异性分子，其包含以SEQIDNO:50-72、106、118-121、138-165或190-193示出的氨基酸序列，并且任选地包含连接至所述分子的N端的甲硫氨酸(Met)。20.根据权利要求19所述的双特异性分子，其还包含连接至所述分子的C端的半胱氨酸。21.根据权利要求1-20中任一项所述的双特异性分子，其偶联至半衰期延长部分。22.根据权利要求21所述的双特异性分子，其中所述半衰期延长部分为结合白蛋白的分子、聚乙二醇(PEG)、白蛋白、白蛋白变体，或免疫球蛋白的Fc区的至少一部分。23.根据权利要求22所述的双特异性分子，其中所述半衰期延长部分为SEQIDNO:189的白蛋白变体。24.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求5所述的双特异性分子。25.一种载体，其包含权利要求24所述的多核苷酸。26.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求25所述的载体。27.一种制备双特异性分子的方法，其包括在使得所述双特异性分子得以表达的条件下温育权利要求26所述的分离的宿主细胞，以及纯化所述双特异性分子。28.一种药物组合物，其包含权利要求1-23中任一项所述的双特异性分子和药学上可接受的载体。29.权利要求1所述的双特异性分子在制备用于治疗患有癌的受试者的药物中的用途，包括向有需要的患者施用治疗有效量的权利要求1所述的双特异性分子并持续足以治疗癌的时间。30.根据权利要求29所述的用途，其中癌与EGFR激活突变、EGFR基因扩增、c-Met激活突变或c-Met基因扩增相关。31.根据权利要求30所述的用途，其中所述EGFR激活突变是G719A、G719X（X为任何氨基酸）、L861X（X为任何氨基酸）、L858R、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、V765M、L858P或T790M替换...

【专利技术属性】
技术研发人员：M安德森，R阿特塔，M迪伊姆，L原，S贾科布斯，A金，D克莱恩，S莫雷斯，K奥内尔，K皮查，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US