一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用，属于生物医药技术领域。抗癌生物活性肽CB1a由天蚕素B改造得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对于肺癌细胞、人胶质瘤细胞、肝癌细胞等的增殖均有一定的抑制作用，CB1a多肽还可以使癌细胞处于生长静止期，并能诱导其晚期凋亡及抑制迁移。CB1a多肽能够用于制备抗癌药物，其比天蚕素B抗癌效果更好。本发明专利技术为抗癌多肽药物的开发和抗癌机理的研究奠定了良好的基础。

An anticancer bioactive peptide CB1a and its application

The invention discloses an anticancer bioactive peptide CB1a and its application, belonging to the field of biomedicine technology. CB1a, an anti-cancer bioactive peptide, was modified from cymbidin B. Its amino acid sequence, as shown in SEQ ID NO.1, can inhibit the proliferation of lung cancer cells, human glioma cells, liver cancer cells and so on. CB1a peptide can also make cancer cells in a stationary phase, and induce their late apoptosis and inhibit migration. CB1a peptide can be used to prepare anticancer drugs, and its anticancer effect is better than that of B. The invention has laid a good foundation for the development and anticancer mechanism of anticancer polypeptide drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及到一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用。
技术介绍
由于当前治疗癌症的方法对机体造成的损伤较大，且容易出现术后炎症反应，因此寻找高效、低毒的抗癌药物一直是当前世界范围内的研究热点之一。近年来，国内外陆续发现了一批具有生物活性的多肽如蛙皮素、蜂毒素、豹毒素等。多肽药物，尤其是抗癌肽由于具有分子量小、靶向性高、毒性低等特点，在癌症临床治疗上具有重要的研究价值及前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种毒性低、特异性强、不易形成耐药性的抗癌生物活性肽CB1a，本专利技术的目的还在于提供所述抗癌生物活性肽CB1a的应用。本专利技术对天蚕素B(CB)进行改造后得到一种效果更好(毒性低、特异性强、不易形成耐药性)的抗癌生物活性肽CB1a，CB1a能够抑制不同类型的癌细胞。本专利技术通过研究发现CB1a对于肺癌细胞A549、人胶质瘤细胞LN-229、肝癌细胞HepG2等的增殖均有一定的抑制作用，CB1a多肽还可以使癌细胞(A549)处于生长静止期，并能诱导其晚期凋亡及抑制迁移，表明CB1a能够用于制备抗癌药物。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种抗癌生物活性肽CB1a，其分子量为4189.32，电荷为+12价，具体氨基酸序列为：KWKVFKKIEK-KWKVFKKIEK-AGP-KWKVFKKIEK-NH2(SEQIDNO.1)。所述抗癌生物活性肽CB1a或含CB1a的组合物在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用。所述抗癌生物活性肽CB1a或含CB1a的组合物在制备诱导癌细胞凋亡的药物中的应用。所述抗癌生物活性肽CB1a或含CB1a的组合物在制备抑制癌细胞迁移的药物中的应用。所述抗癌生物活性肽CB1a或含CB1a的组合物在制备抗癌药物中的应用。所述的癌细胞包括肺癌细胞、人胶质瘤细胞、肝癌细胞等。本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术的抗癌生物活性肽CB1a比天蚕素B(CB)抗癌效果更好，且毒性更低，为癌症的治疗提供了新的药物，为抗癌多肽药物的开发和抗癌机理的研究奠定了良好的基础。附图说明图1是CB1a在类膜环境中的二级结构图。图2是不同浓度CB1a对A549细胞增殖影响的结果图。图3是CB1a对肺癌细胞A549周期影响的结果图。图4是CB1a处理A549细胞24h后的AO/EB染色结果图(400×)。图5是CB1a处理A549细胞后AnnexinV-iFlour/PI双染检测细胞凋亡散点图。图6是CB1a处理A549细胞后不同时间段的迁移变化图(100×)。图7是CB1a对A549细胞迁移率影响的结果图。图8是不同浓度CB1a对LN-229细胞增殖影响的结果图。图9是不同浓度CB1a对HepG2细胞增殖影响的结果图。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1一、CB1a多肽的合成与配制(1)CB1a多肽由强耀生物多肽有限公司合成，其氨基酸序列如下：KWKVFKKIEK-KWKVFKKIEK-AGP-KWKVFKKIEK-NH2。天蚕素B(CB)的氨基酸序列：KWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKAL。CB1a多肽有着33个氨基酸和净+12价，由CBN-端原本的10个氨基酸KWKVFKKIEK重复3次，并且在第二次和第三次重复之间保留天蚕素的保守的铰链序列AGP构建而成。KWKVFKKIEK是两性的α-螺旋，一端亲水，一端疏水；AGP是连接2个螺旋的铰链桥。扭结处的脯氨酸残基对肽的离子通道门控和寡聚化起作用。CB1a的寡聚化影响其抗癌效果。CB1a多肽在类膜环境中的二级结构图如图1所示，CB1a会形成螺旋-铰链-螺旋的结构，且铰链具有灵活性、可变性，因而2个螺旋结构间的铰链弯曲角度在60°到110°之间。(2)取1mgCB1a加100μL无菌水配制成2mM的储存液，10μL分装成10管，然后再取2mM的储存液稀释成若干管浓度为200μM，备用。在进行实验前，放在-20度冰箱保存。二、A549细胞的培养与处理肺癌细胞A549用F12K培养基(含10％FBS)进行培养，根据实验要求加入不同浓度的CB1a，对照组则使用CB处理。三、A549细胞的活力检测(1)接种细胞：在37℃、5％CO2培养条件下，用含10％FBS的F12K培养基在6cm皿中培养A549细胞，待细胞铺满皿底的80％左右时，将其稀释成50000个/mL，加入到96孔板中，每孔加入100μL，即接种密度在5000个/孔，边缘则用无菌的PBS进行填充。(2)加药：设置2-4个浓度梯度的加药(CB1a)实验组、对照组(CB)，每个浓度梯度做3个重复。待前一天所铺的细胞贴壁后，弃去孔内旧的培养液并补加100μL新鲜培养基，然后于相应试验孔加入不同浓度的CB1a和天蚕素CB。(3)加MTT：加药处理24h后，在96孔板每孔中加入20μLMTT后置于培养箱孵育4h。(4)溶解：孵育4h后取出96孔板，小心吸弃孔内培养上清液终止培养。然后每孔加150μLDMSO，震荡8-10min，使甲臜结晶充分溶解。(5)比色：待甲臜充分溶解后，以OD570nm测量各孔的吸光值。按下式计算存活率与抑制率：存活率(％)＝实验组平均值/阴性对照平均值×100％；抑制率(％)＝1-存活率。结果见图2，在浓度20-100μM的浓度范围内，CB1a都比CB表现出良好的抑制肺癌细胞A459增殖能力的作用。四、A549细胞的周期检测(1)铺24孔培养板：用含10％胎牛血清的F12K培养基在6cm皿中培养A549细胞，待细胞生长铺满皿底的80％左右时弃掉旧的培养基，用PBS洗涤一遍后加入500μL胰酶(0.25％含EDTA)消化，将皿置于37度培养箱消化1-2min，待细胞变圆后加入1mL新鲜的含10％胎牛血清的F12K培养基终止消化，小心吹打悬浮后补加新鲜培养基至3mL。然后将细胞密度稀释成1×105个/mL，加入到24孔板中，每孔加入500μL，最后把培养板置于37℃、CO2培养箱中过夜培养12h。(2)CB1a处理：观察A549细胞生长状态，待绝大多数细胞贴壁后就可以进行加药理：实验组细胞每孔(500μL培养液)加入终浓度为20μM的CB1a处理，对照组加终浓度为20μM的CB。(3)收集细胞：细胞经过CB1a或CB处理24h后用胰酶消化1-2min，待细胞变圆后加入500μL新鲜培养基终止消化并吹打悬浮。然后用移液枪将细胞悬液转移至EP管中，1000rpm离心5min。(4)洗涤细胞：弃上清，PBS洗涤2次。(5)乙醇固定：接着加入300μLPBS溶液重悬细胞，待细胞充分分散后加入700μL无水乙醇(即终浓度为70％乙醇)悬浮，4℃固定过夜。(6)PI染色：固定过夜的细胞于离心机3000rpm离心5min，弃掉上清，加80μLPI，4℃避光孵育30min。(7)流式细胞仪检测：PI选用FL2通道检测。结果见图3，CB1a处理过的癌细胞G2期只有4.8％相比CB处理癌细胞组的21.7％明显减少，同时CB1a处理过的癌细胞G1期66.5％相比CB处理癌细胞组的51.7％明显增多，说明CB1a处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗癌生物活性肽CB1a，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗癌生物活性肽CB1a，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的抗癌生物活性肽CB1a在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用。3.含权利要求1所述的抗癌生物活性肽CB1a的组合物在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用。4.权利要求1所述的抗癌生物活性肽CB1a在制备诱导癌细胞凋亡的药物中的应用。5.含权利要求1所述的抗癌生物活性肽CB1a的组合物在制备诱导癌细胞凋亡的药物中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军林，解举民，赖晓晶，程烨，岳硕豪，
申请(专利权)人：湖北汉元基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42