本发明专利技术涉及杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中的应用。一种分离自杜梨的MYB转录因子基因Pb4RMYB，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将Pb4RMYB基因转化拟南芥，获得的转基因植株经生物学功能验证，Pb4RMYB基因过表达植株，相比野生型对照植株，对高盐逆境胁迫的耐受性显著提高。本发明专利技术对植物耐盐分子机理的研究具有重要意义；另外，该基因在培育耐盐果树砧木或品种中具有重要功能，从而为培育抗逆果树新品种提供了重要的可能性，对果树生产具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中的应用
本专利技术涉及杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中的应用，属于生物
技术介绍
随着工业污染加剧、灌溉农业的发展以及化肥使用不当等原因，土壤次生盐渍化日趋加重，目前已成为影响农业生产的世界性问题，全球近20％的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁。对于果树生产而言，土壤盐渍化已成为限制果树生产和分布的主要因子之一。盐碱地果树生长发育的主要障碍是过高的盐分浓度。由于盐碱地淋溶作用弱，所以大量的盐分离子会聚集在根系附近，从而对果树生长产生胁迫；而且易发生盐离子毒害，引起营养缺乏，降低成活率；在离子拮抗等作用下，易发生中微量元素缺乏，生理病害严重；另外，盐含量过高对土壤胶体具有很强的分散作用，导致土壤容易板结，导致土壤通透性差，严重影响土壤微生物的代谢，最终导致土壤日益贫瘠，从而影响果树的生长发育，尤其不适合深根性果树的生长。MYB转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域通常含有1-4个不完全重复的氨基酸序列(R)。根据含有R的多少，MYB家族转录因子被分为四类，1R-，R2R3-，3R-和4R-MYB转录因子。其中，植物中绝大多数MYB属于R2R3-MYB型，由数量众多的基因家族编码，主要与植物环境胁迫应答密切相关；3R-MYB主要与细胞周期控制相关，在高等植物基因组中一般由5个基因编码；数量最少的为4R-MYB型，在多种植物基因组中只存在1个，目前对其功能知之甚少。在砀山酥梨(PyrusbretschneideriRehd.)基因组中，存在129个MYB基因，分属于31个亚家族，分布于16条染色体上。MYB转录因子广泛参与植物次生代谢调控、细胞形态决定、胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等。梨是温带地区的主要栽培树种，其果品营养价值高，耐贮性好，供应周期长，世界上很多国家都将其列为主要消费果品。与多数果树一样，梨主要靠嫁接繁殖，所以梨的耐盐性问题实质是砧木的耐盐性问题，选择耐盐性高的砧木是提高梨耐盐性的关键措施之一。杜梨原产中国，广泛用作梨栽培品种的砧木，具有耐旱、耐涝、耐盐等优良特性，对环境的适应能力较强，嫁接后可以提高品种的抗逆性。由于梨是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。近年来，梨基因组测序(JunWu等，2013)的完成以及现代生物技术的迅速发展为通过基因工程手段改良植物抗逆性开辟了新途径。果树砧木生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。目前对MYB的研究主要集中在拟南芥、水稻、大豆等少数模式植物上，而在果树方面研究较少。因此挖掘梨MYB基因并进行功能研究，为梨抗逆育种提供潜在的有效候选基因，不但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中的应用。本专利技术通过植物基因工程技术将Pb4RMYB基因转化拟南芥，得到耐盐性提高的植株，首次证实Pb4RMYB基因与植物耐盐性相关，这为果树抗逆基因工程提供了重要的基因资源。本专利技术的技术方案如下：杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性方面的应用，所述杜梨Pb4RMYB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述杜梨Pb4RMYB基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步的，杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高果树耐盐性方面的应用。更进一步的，杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高拟南芥耐盐性方面的应用。Pb4RMYB基因是从杜梨(PyrusbetulifoliaBunge)中克隆获得的，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码区序列(CDS)长度为2913bp，编码954个氨基酸残基，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，预测编码蛋白质具有4个保守的SANT结构域，分子量为109600.6Da，等电点为7.41，不含信号肽和跨膜区。克隆Pb4RMYB基因cDNA序列：正向引物Pb4RMYB-F1：5’-ATGTCTCCTCCCTCCGATGACG-3’；反向引物Pb4RMYB-R1：5’-TTAACCACATTGACGCCGCCTCTTCG-3’。利用qRT-PCR技术分析了在杜梨响应高盐胁迫过程中Pb4RMYB基因的表达模式，结果表明Pb4RMYB在高盐胁迫下被诱导上调表达，且在叶片、根中的表达量明显高于花和果实，说明Pb4RMYB可能与杜梨的耐盐性相关。构建了杜梨Pb4RMYB的亚细胞定位融合表达载体pCAMBIA1302-Pb4RMYB-GFP，通过农杆菌介导进行烟草瞬时表达，结果表明Pb4RMYB定位于细胞核。构建了杜梨Pb4RMYB基因的植物过表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将Pb4RMYB基因转化拟南芥，获得的转基因植株经种子萌发及耐盐性分析，表明本专利技术克隆的Pb4RMYB基因具有提高拟南芥耐盐性的功能。果树等木本经济作物因遗传转化周期太长，基因功能的鉴定往往在模式植物(如拟南芥、番茄等)中进行，将外源基因导入模式植物中，若表现相应的表型或性状，则可以推断该基因具有相应的功能。本专利技术将Pb4RMYB基因转化拟南芥，发现转基因拟南芥的耐盐性提高，说明该基因为盐胁迫诱导基因，该基因上调表达可以提高植物的耐盐性。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：本专利技术利用转基因技术得到耐盐性提高的拟南芥植株，突破了传统育种手段的障碍，为果树等抗逆基因工程提供了重要的候选基因资源。附图说明图1为Pb4RMYB基因在杜梨叶片响应200mmol/L甘露醇胁迫的qRT-PCR分析图；图2为Pb4RMYB基因在杜梨叶片响应200mmol/LNaCl胁迫的qRT-PCR分析图；图3为Pb4RMYB基因的亚细胞定位图，其中，A为明场条件下，B为GFP荧光条件下，C为自发光条件下，D为荧光和自发光叠加条件下；图4为Pb4RMYB基因在转基因拟南芥叶片中的表达量分析图，其中，WT为野生型拟南芥；1-6为阳性转Pb4RMYB基因拟南芥株系；图5为野生型和过表达拟南芥种子在1/2MS培养基生长5天后表型；图6为野生型和过表达拟南芥种子在含150mmol/LNaCl的1/2MS培养基生长萌发5天后的表型；图7为野生型和Pb4RMYB过表达拟南芥种子在150mmol/LNaCl胁迫下种子萌发率；图8为Pb4RMYB-OE和野生型拟南芥在200mmol/LNaCl胁迫7d并恢复2d后的表型，对照(WT)浇纯水；图9为Pb4RMYB-OE和野生型拟南芥在NaCl胁迫下的SPAD值，对照浇纯水；图10为在盐胁迫处理后野生型和T3转基因株系中Pb4RMYB的表达；图11为在盐胁迫处理后野生型和T3转基因株系中盐胁迫响应基因AtNHX1和AtSOS1的表达。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。下述实施例中所使用的实验本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因在提高植物耐盐性方面的应用，所述杜梨Pb4RMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因在提高植物耐盐性方面的应用，所述杜梨Pb4RMYB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因在提高果树耐盐性方面的应用。3.如权利要求1所述杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因在提高拟南芥耐盐性方面的应用。4.如权利要求1所述杜梨...
【专利技术属性】
技术研发人员：冉昆，孙晓莉，王少敏，魏树伟，董肖昌，
申请(专利权)人：山东省果树研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。