高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，涉及溶菌酶分析检测技术领域。所述检测方法包括：(a)建立溶菌酶标准曲线：采用0.05‑0.08mol/L pH＝6.0‑6.5的磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准品溶解并稀释成不同浓度梯度，通过紫外分光光度法在279‑283nm波长处测定吸光度值；(b)检测样品：取待测珍禽蛋蛋清样品用磷酸盐缓冲液稀释，按照与标准品相同的方式分析，测定检测样品的吸光度值，根据所述吸光度值由标准曲线计算待测珍禽蛋蛋清样品中溶菌酶含量。本发明专利技术采用低浓度磷酸盐缓冲液体系使溶菌酶的测定结果更加准确，且精密度更好，灵敏度高，回收率更高，适用于高原特种养殖珍禽蛋溶菌酶测定。

Detection method of lysozyme in egg white of special cultured rare birds in Plateau

The invention discloses a detection method for lysozyme in egg white of plateau special breeding rare poultry, which relates to the technical field of lysozyme analysis and detection. The detection method includes: (a) establishing a lysozyme standard curve: dissolving and diluting the lysozyme standard into different concentration gradients with a phosphate buffer of 0.05 0.08mol/L pH=6.0 6.5, and determining the absorbance value at 279 283 nm wavelength by ultraviolet spectrophotometry; (b) testing the sample: taking the sample of rare egg white to be measured. Diluted with phosphate buffer and analyzed in the same way as the standard sample, the absorbance value of the detected sample was determined, and the lysozyme content in the rare egg white sample was calculated from the standard curve according to the absorbance value. The method adopts a low concentration phosphate buffer liquid system to make the determination result of lysozyme more accurate, with better precision, high sensitivity and higher recovery rate, and is suitable for the determination of lysozyme in plateau special breeding rare poultry eggs.

【技术实现步骤摘要】
高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法
本专利技术涉及溶菌酶分析检测
，具体而言，涉及一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法。
技术介绍
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中，其中以蛋清含量最为丰富。GBT25879-2010中记载了鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定方法，具体包括：溶菌酶用0.9％氯化钠稀释成不同梯度浓度(例如0、0.2、0.4、0.8、1mg/mL)，以溶菌酶工作液浓度为横坐标，281nm波长处吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出回归方程。然后将蛋清用0.9％氯化钠稀释，乙酸调溶液至pH4.5，77℃水浴10min后取出，静置1h，离心取上清，按照标准曲线绘制的操作测得OD281值，由标准曲线回归方程计算蛋清溶液中溶菌酶的含量，再乘以稀释倍数即为蛋清中溶菌酶的含量。前期研究表明，以高原地区特种养殖的珍禽蛋作为原料提取溶菌酶，可制得高活力的优质溶菌酶，在天然防腐剂市场可形成巨大的竞争力。传统方法采用0.9％氯化钠作为体系的稀释溶液，盐浓度过高，容易影响溶菌酶含量测定的准确性，后期需要调节体系pH，操作繁琐，造成测定结果不准确。同时，该方法是一种普适方法，而高原地区特种养殖的珍禽蛋中溶菌酶含量较常规蛋类高很多，如果采用该方法测定容易造成结果不准确，目前还没有一种完全适用于高原特种养殖珍禽蛋中溶菌酶的检测方法。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，该方法利用分光光度法，采用磷酸盐缓冲液作为标准品和待测样品的稀释溶液，非常适合于高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测，检测精密度好、准确度高。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术提供了一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，包括以下步骤：(a)建立溶菌酶标准曲线：采用pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准品溶解并稀释成不同浓度梯度，通过紫外分光光度法在279-283nm波长处测定吸光度值，建立溶菌酶标准曲线；(b)检测样品：取待测珍禽蛋蛋清样品用所述磷酸盐缓冲液稀释，按照与标准品相同的分析方式测定检测样品的吸光度值，根据所述吸光度值由标准曲线计算待测珍禽蛋蛋清样品中溶菌酶含量；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05-0.08mol/L。优选地，在本专利技术技术方案的基础上，磷酸盐缓冲液的pH为6.0-6.2，和/或，磷酸盐缓冲液的浓度为0.06-0.08mol/L。进一步优选地，在本专利技术技术方案的基础上，磷酸盐缓冲液的pH为6.0-6.2，和/或，磷酸盐缓冲液的浓度为1/15-1/14mol/L。优选地，在本专利技术技术方案的基础上，步骤(a)中在280-282nm波长处测定吸光度值，优选在281nm波长处测定吸光度值。优选地，在本专利技术技术方案的基础上，磷酸盐缓冲液的配制包括以下步骤：每15-25mL的1/15-1/14mol/LNa2HPO4溶液与75-85mL的1/15-1/14mol/LNaH2PO4溶液混合。优选地，在本专利技术技术方案的基础上，步骤(a)中溶菌酶标准品溶解后的浓度为300-800μg/mL，优选400-600μg/mL，进一步优选400-500μg/mL。优选地，在本专利技术技术方案的基础上，溶解后将溶菌酶标准品分别稀释20倍、10倍、20/3倍、5倍、4倍和10/3倍，得到不同浓度梯度工作液，并以磷酸盐缓冲液为参比液建立溶菌酶标准曲线。优选地，在本专利技术技术方案的基础上，步骤(b)中待测珍禽蛋蛋清样品用磷酸盐缓冲液稀释100-500倍，优选稀释200-400倍，进一步优选稀释200-300倍。优选地，在本专利技术技术方案的基础上，高原特种养殖珍禽蛋包括在高原散养并饲喂纯天然植物饲料的中华黑白凤乌骨鸡蛋、贵妃鸡蛋、珍珠鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋或大雁蛋。优选地，在本专利技术技术方案的基础上，高原特种养殖珍禽蛋溶菌酶检测方法，包括以下步骤：(a)配制磷酸盐缓冲液：每15-25mL的1/15-1/14mol/LNa2HPO4溶液与75-85mL的1/15-1/14mol/LNaH2PO4溶液混合，得到1/15-1/14mol/LpH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液；(b)配制溶菌酶标准工作液：称取溶菌酶标准品，用所述磷酸盐缓冲液溶解成400-500μg/mL的溶菌酶标准工作液，于4-6℃密封保存备用；(c)建立溶菌酶标准曲线：采用所述磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准工作液分别稀释20倍、10倍、20/3倍、5倍、4倍和10/3倍，得到不同浓度梯度工作液，以磷酸盐缓冲液为参比液，通过紫外分光光度法在281nm波长处测定吸光度值，以工作液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出标准曲线回归方程；(d)检测样品：取待测珍禽蛋蛋清样品，用3-5层纱布过滤，取过滤试样，用磷酸盐缓冲液稀释200-300倍，得到试样溶液，按照绘制标准曲线的操作步骤，在波长281nm处测定试样溶液吸光度值，平行测定三次，取结果的算术平均值，由标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度。和现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：本专利技术以紫外分光光度-标准曲线法对溶菌酶含量进行分析，其中采用0.05-0.08mol/LpH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液作为体系的稀释溶液，缓解了现有检测方法不适用于高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的测定，采用0.9％氯化钠作为稀释溶液容易造成测定结果不准确的问题。经试验测定，采用本专利技术方法检验高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶含量，准确度高，蛋清溶液中添加溶菌酶标准品浓度在17mg/mL～51mg/mL范围内，平均加标回收率≥99％；精密度好，批内变异系数≤1％，批间变异系数≤2％；灵敏度高，最低检测限为0.3μg/mL。本专利技术检测方法操作简单、耗时短、针对性强，适于实际应用，非常适合于高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测，检测精密度好、准确度高。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。根据本专利技术的一个方面，提供了一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，包括以下步骤：(a)建立溶菌酶标准曲线：采用pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准品溶解并稀释成不同浓度梯度，通过紫外分光光度法在279-283nm波长处测定吸光度值，建立溶菌酶标准曲线；(b)检测样品：取待测珍禽蛋蛋清样品用所述磷酸盐缓冲液稀释本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)建立溶菌酶标准曲线：采用pH＝6.0‑6.5的磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准品溶解并稀释成不同浓度梯度，通过紫外分光光度法在279‑283nm波长处测定吸光度值，建立溶菌酶标准曲线；(b)检测样品：取待测珍禽蛋蛋清样品用所述磷酸盐缓冲液稀释，按照与标准品相同的分析方式测定检测样品的吸光度值，根据所述吸光度值由标准曲线计算待测珍禽蛋蛋清样品中溶菌酶含量；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05‑0.08mol/L。

【技术特征摘要】
1.一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)建立溶菌酶标准曲线：采用pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准品溶解并稀释成不同浓度梯度，通过紫外分光光度法在279-283nm波长处测定吸光度值，建立溶菌酶标准曲线；(b)检测样品：取待测珍禽蛋蛋清样品用所述磷酸盐缓冲液稀释，按照与标准品相同的分析方式测定检测样品的吸光度值，根据所述吸光度值由标准曲线计算待测珍禽蛋蛋清样品中溶菌酶含量；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05-0.08mol/L。2.按照权利要求1所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的pH为6.0-6.2，和/或，磷酸盐缓冲液的浓度为0.06-0.08mol/L。3.按照权利要求1所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的pH为6.0-6.2，和/或，磷酸盐缓冲液的浓度为1/15-1/14mol/L。4.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，其特征在于，步骤(a)中在280-282nm波长处测定吸光度值，优选在281nm波长处测定吸光度值。5.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的配制包括以下步骤：每15-25mL的1/15-1/14mol/LNa2HPO4溶液与75-85mL的1/15-1/14mol/LNaH2PO4溶液混合。6.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，其特征在于，步骤(a)中溶菌酶标准品溶解后的浓度为300-800μg/mL，优选400-600μg/mL，进一步优选400-500μg/mL。7.按照权利要求6所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶的检测方法，其特征在于，溶解后将溶菌酶标准品...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯全忠，邓玉林，孟薇薇，李月海，曲淑华，索文敏，戴荣继，陈艳，孟世英，胡志成，孙俐丽，
申请(专利权)人：青海华杰实业有限公司，北京理工亘元科技有限公司，
类型：发明
国别省市：青海,63