一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，包括正向引物、反向引物、第一探针和第二探针，第一探针和第二探针为两条错位双向探针，第一探针与反向模板相匹配，第二探针与正向模板相匹配。一种包括上述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。采用乙型肝炎病毒A‑H共8个型别多个亚型生物信息学分析，在S区段保守区设定引物探针区段，能很好覆盖8个HBV型别和各个亚型。探针采用两条错位双向探针，使探针能同时覆盖两个区段序列，同时针对两个保守基因区段进行检测，同时由于探针不进行互补配对，因此不会影响探针之间的结合效率。

Double probe composition for detecting hepatitis B virus and kit

The invention discloses a double probe composition for detecting hepatitis B virus, including forward primer, reverse primer, first probe and second probe. The first probe and the second probe are two dislocation bidirectional probes. The first probe matches the reverse template and the second probe matches the forward template. A reagent kit for detecting hepatitis B virus including the above-mentioned composition for detecting hepatitis B virus also includes a PCR buffer, dNTPs, Taq enzyme, UNG enzyme and a nucleic acid extraction reagent. Using bioinformatics analysis of 8 subtypes of hepatitis B virus A H, primer probe region was set in conservative region of S region, which could well cover 8 HBV subtypes and each subtype. Two dislocated bi-directional probes are used to cover the two sequences simultaneously and detect the two conserved gene segments. The binding efficiency between the probes is not affected because the probes do not complement each other.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒
本专利技术涉及乙型肝炎病毒(HBV)的检测
，尤其涉及一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害全球人类健康的感染性病毒，病毒感染呈世界性流行，我国属于乙型肝炎感染地方性流行区。急性和慢性HBV感染易引发多器官损坏，可能导致肝硬化、肝癌、肝衰竭等疾病的发生。因此，在乙型肝炎的抗病毒治疗中对乙肝感染患者体内HBV载量准确定量检测显得非常重要。此外，乙型肝炎病毒基因组具有多基因型和高突变性，市场上HBVDNA检试剂一般针对HBV基因中遗传变异较小的S区基因进行检测，虽然该区域相对保守，但HBV基因组的高突变型和同基因型个别位点多态性等特点，在引物探针结合区域的碱基序列难以完全覆盖所有亚型间的保守区段，另外对于未发现基因亚型或突变多态性位点，往往容易出现漏检的情况。目前已有类似针对不同区段进行同时检测的报道，如凯杰生物工程(深圳)有限公司在专利“用于检测人乙型肝炎病毒的引物组和探针”中提出同时检测HBVS区和前核心区的报道；再有珠海丽珠试剂股份有限公司在专利“检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法”中提出使用三组引物探针同时检测HBV基因组的三个保守基因区域的报道。虽然两组引物探针和三组引物探针现对于单基因检测，能大大降低漏检的风险，同时能避免单个位点突变导致无法检出的假阴性的风险，但反应体系中同时存在两组或三组引物使扩增反应成为双重或三重PCR，由于不同的引物组具有较大差异的扩增效率、退火温度、引物组间竞争以及二聚体情况，所以对于试剂的灵敏度和准确度具有较大的影响。为此，仍然需要一种高度准确、灵敏度、特异性更好、突变包容性更好的HBV核酸定量检测组合物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，具有灵敏度高的特点。本专利技术的另一目的在于提出一种用于检测乙肝病毒的试剂盒，具有灵敏度高的特点。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，包括正向引物、反向引物、第一探针和第二探针，第一探针和第二探针为两条错位双向探针，第一探针与反向模板相匹配，第二探针与正向模板相匹配。进一步的，正向引物具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列，反向引物具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，第一探针具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，第二探针具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。进一步的，还包括内标探针，内标探针具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列。进一步的，第一探针、第二探针和内标探针三者的两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，第一探针和第二探针两者的荧光基团与内标探针的荧光基团不同。进一步的，正向引物、反向引物、第一探针、第二探针和内标探针的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。进一步的，第一探针、第二探针和/或内标探针的5’端和/或3’端增加多个碱基使其形成二级结构。一种包括上述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。进一步的，引物、探针、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶混合并加入无DNase和RNase纯化水成为PCR反应预混液，PCR反应预混液的配方如下：PCR缓冲液10μL；100mMdNTPs(ATCGU)0.27-1.35μL；50μM正向引物0.25-1.5μL；50μM反向引物0.25-1.5μL；50μM第一探针0.05-0.8μL；50μM第二探针0.05-0.8μL；50μM内标探针0.05-0.8μL；Taq酶0.5-1μL；UNG酶0.02-0.15μL；加入无DNase和RNase纯化水至终体积20μL。进一步的，核酸提取试剂包括细胞裂解液450μL、磁珠混合液40μL、第一洗涤液500μL、第二洗涤液500μL和洗脱液30-120μL；细胞裂解液包括2.5M异硫氰酸胍、10％曲拉通X100和15％异丙醇；磁珠混合液包括超顺纳米磁性粒子、蛋白酶K、62.5copy/μL内标质粒和50％甘油；第一洗涤液包括1M异硫氰酸胍和50％无水乙醇；第二洗涤液包括TRIS/氯化钠和50％无水乙醇；洗脱液为无DNase和RNase去离子水。本专利技术的有益效果为：1、采用乙型肝炎病毒A-H共8个型别多个亚型生物信息学分析，在S区段保守区设定引物探针区段，能很好覆盖8个HBV型别和各个亚型。2、引物选取高CG区段，在提高序列TM值的同时能有效缩短序列长度(≤20bp)，减少引物自身折叠，使引物有效与模板搭配；同时由于引物序列碱基的减少，使试剂定量标准品与检测样本环境差异(干扰核酸，干扰蛋白等)的影响降到最低，引物在较宽的干扰环境下仍能保持稳定的模板结合效率进行扩增，有效提高试剂定量的准确度。3、探针采用两条错位双向探针，一条探针与反向模板匹配，另一条探针与正向模板匹配，使探针能同时覆盖两个区段序列，同时针对两个保守基因区段进行检测，避免未知突变导致探针无法匹配出现的假阴性，同时由于探针不进行互补配对，因此不会影响探针之间的结合效率,探针设计方面，选取高CG区段，由于探针长度(≤22bp)减少，减少探针自身折叠，使探针有效与模板搭配；同时探针长度缩短使淬灭基团更有效吸收荧光信号，有效降低整个反应体系的荧光本底噪音，提高试剂灵敏度和准确度。附图说明图1是本专利技术实施例1中定量浓度对数与理论浓度对数的线性范围和相关系数图；图2是本专利技术实施例2的各亚型各浓度扩增曲线图；图3是本专利技术实施例4中10000IU/mL浓度20复孔精密度图；图4是本专利技术实施例4中1000IU/mL浓度20复孔精密度图；图5是本专利技术实施例4中100IU/mL浓度20复孔精密度图；图6是本专利技术实施例5中15IU/mL其中10复孔扩增曲线图；图7是本专利技术实施例5中7.5IU/mL其中10复孔扩增曲线图；图8是本专利技术实施例5中3.5IU/mL其中10复孔扩增曲线图；图9是本专利技术实施例5中2IU/mL其中10复孔扩增曲线图。具体实施方式下面结合附图及具体实施方式进一步说明本专利技术的技术方案。一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，包括正向引物、反向引物、第一探针和第二探针，第一探针和第二探针为两条错位双向探针，第一探针与正向模板相匹配，第二探针与反向模板相匹配。两条错位双向探针的设计能使探针能同时覆盖两个区段序列，同时针对两个保守基因区段进行检测，避免未知突变导致探针无法匹配出现的假阴性，同时由于探针不进行互补配对，因此不会影响探针之间的结合效率。进一步的，正向引物具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列，反向引物具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，第一探针具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，第二探针具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。进一步的，还包括内标探针，内标探针具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列。引物组、两条检测探针及内标探针的碱基序列如表1所示。表1名称碱基序列(5’-3’)长度SEQIDNO.1TGTATTCCCATCCCATCATC20SEQIDNO.2ACAGTGGGGGAAAGCC16SEQIDNO.3CCTATGGGAGTGGGCCTCAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，包括正向引物、反向引物、第一探针和第二探针，所述第一探针和第二探针为两条错位双向探针，所述第一探针与反向模板相匹配，所述第二探针与正向模板相匹配。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，包括正向引物、反向引物、第一探针和第二探针，所述第一探针和第二探针为两条错位双向探针，所述第一探针与反向模板相匹配，所述第二探针与正向模板相匹配。2.根据权利要求1所述的用于检测乙肝病毒的引物组，其特征在于，所述正向引物具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述第一探针具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，所述第二探针具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，还包括内标探针，所述内标探针具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，所述第一探针、第二探针和内标探针三者的两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，所述第一探针和第二探针两者的荧光基团与内标探针的荧光基团不同。5.根据权利要求3所述的用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，所述正向引物、反向引物、第一探针、第二探针和内标探针的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。6.根据权利要求3所述的用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，所述第一探针、第二探针和/或内标探针的5’端和/或3’端增加多个碱基使其形成二级结构。7.包括权利要求4所述的用于检测乙肝病毒组...

【专利技术属性】
技术研发人员：冼伟杰，
申请(专利权)人：佛山市优特医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44