调控自杀基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵系统技术方案

本发明专利技术属于生物技术，具体公开了一种调控自杀基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵系统，包括：(1)由AFP启动子驱动表达的Cre重组酶基因；(2)由SURV启动子驱动表达的自杀基因；所述SURV启动子与所述自杀基因之间插入一段LoxP‑Stop‑LoxP序列，Stop为转录终止序列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列。本发明专利技术利用了AFP启动子在肝癌HepG2细胞里驱动Cre重组酶的表达，Cre重组酶将两个LoxP之间的转录终止序列Stop剪切出去，使得肿瘤特异性的SURV启动子可以直接驱动TK/GCV的表达，特异性诱导肝脏肿瘤细胞凋亡而不损伤体内其他任何别的类型的细胞。

Manipulation system for regulating suicide gene expression in liver tumor cells

The invention belongs to biotechnology and discloses a manipulation system for regulating the specific expression of suicide genes in liver tumor cells, including: (1) a Cre recombinase gene driven by an AFP promoter; (2) a suicide gene driven by a SURV promoter; and a Lox segment inserted between the SURV promoter and the suicide gene. Stop sequence is P terminus Stop LoxP LoxP, LoxP is the specific recognition sequence of Cre recombinase. The invention utilizes AFP promoter to drive the expression of Cre recombinase in HepG2 cells of hepatocellular carcinoma, and Cre recombinase cuts out the stop sequence between two LoxP transcription termination sequences, so that the tumor-specific SURV promoter can directly drive the expression of TK/GCV, and specifically induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells without damaging any other in vivo. The type of cells.

【技术实现步骤摘要】
调控自杀基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵系统
本专利技术属于生物技术，具体地说，涉及一种调控自杀基因在肝脏肿瘤细胞中高效特异性表达的操纵系统。
技术介绍
肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)的发病率和疾病相关的死亡率分别位列全球癌症调查的第6位和第3位，每年全球70万新发肝癌病例中有超过55％在我国，未经治疗的患者通常在明确诊断后3～6个月内死亡。肝切除和肝移植是目前最主要的HCC根治性治疗手段，然而，切缘阴性的肝切除患者仍有40％会在手术后一年内复发；即使遵循最严格的选择标准(即米兰标准：单发肿瘤直径≤5cm，或多发肿瘤数目≤3个且最大直径≤3cm，无大血管浸润或肝外转移)仍有超过10％患者在手术后1年内复发，并继而导致几乎所有复发患者的死亡。当肿瘤体积较大、侵犯血管或多发转移，超出外科有效根治标准时，非手术治疗也不尽人意；化学治疗联合立体定向放疗在过去几年内虽有所成效，但因不能精确控制放疗剂量，增加了肝脏和黏膜组织伤害，远难达到根治效果。近10年来，随着分子生物学和基因工程技术进展，基因治疗开启肿瘤治疗领域研究的新热点，成为恶性肿瘤非手术治疗的主导方向。其中，以腺病毒为载体的胸苷激酶自杀基因系统(Thymidinekinase/Ganciclovir,TK/GCV)研究开展的最早也最为广泛，多项动物实验和临床研究表明该系统有望成为肝癌治疗的有效选择。但是，腺病毒的自我复制特性和靶向细胞的不可控性，却限制了该体系在临床中的有效应用。不仅如此，肝癌自杀基因治疗多数处于动物和临床试验阶段，制约其推广的主要问题在于安全性和有效性，包括治疗基因表达的选择性不高，针对肝癌细胞的靶向性不强，自杀基因或载体本身对正常肝细胞会产生毒副作用等。因此，急需开发一种可特异性靶向肝癌细胞并可高效调控自杀基因表达的操纵系统。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种调控自杀基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵系统。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供一种调控自杀基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵系统，所述系统包括：(1)由AFP(甲胎蛋白)启动子驱动表达的Cre重组酶基因；(2)由SURV(生存素，Survivin)启动子驱动表达的自杀基因；所述SURV启动子与所述自杀基因之间插入一段LoxP-Stop-LoxP序列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列，Stop为一种转录终止序列(也可称为终止码)，当其被SURV启动子驱动表达时，其将阻遏其下游的自杀基因表达。当在Cre重组酶作用下，通过同源重组机制删除其特异性识别位点之间的转录终止序列Stop，从而解除Stop序列对SURV启动子驱动的转录过程的阻遏作用，可使其下游的自杀基因在SURV启动子的驱动下，在肝脏肿瘤细胞中特异性高效表达。作为优选，本专利技术采用TK基因作为所述自杀基因。本专利技术所述的AFP启动子、Cre重组酶基因、SURV启动子、LoxP、Stop、TK基因均为本领域已知的基因元件。本专利技术对现有技术的贡献并不在于改变了这些元件本身的序列或性质，而是提出了一种新的组装策略，得到了一种高特异性靶向肝癌细胞，并可实现精准调控的操纵系统。需要说明的是，所述系统可以多种形式体现，例如，以载体组合的形式体现。具体地说，所述系统包括两个rAAV(重组腺相关病毒)载体：其一，含有HCC特异性表达的AFP启动子元件，以及可被AFP启动子驱动表达的Cre重组酶基因；命名为rAAV-AFP-Cre；其二，含有SURV启动子元件，以及可被SURV启动子驱动表达的LoxP-Stop-LoxP-TK/GCV表达框，其中，LoxP-Stop-LoxP位于TK/GCV的上游，命名为rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK。所述载体均以AAV(腺相关病毒)作为出发载体，采用基因工程的常规技术手段将所述元件/表达框插入其中。本专利技术通过流式细胞技术验证上述两种rAAV载体共同处理的体外培养HepG2细胞凋亡率和细胞毒性，研究发现当rAAV-AFP-Cre和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK同时感染GCV处理的HepG2细胞时，由于AFP启动子在肝癌HepG2细胞里驱动Cre重组酶的表达，Cre的表达将两个LoxP之间的转录终止序列Stop剪切出去，使得肿瘤特异性的SURV启动子可以直接驱动TK/GCV的表达，特异性诱导肝脏肿瘤细胞凋亡而不损伤体内其他任何别的类型的细胞，初步证实了转染高效、方法稳定、可操作、可重复。进一步地，本专利技术通过建立人HCC皮下种植瘤裸鼠模型，并由尾静脉注射两种rAVV载体系统，进一步研究其对实验模型HCC种植瘤的凋亡率、抑瘤率和模型生存状况、以及正常细胞和组织的损害程度，进一步验证该系统的稳定性、有效性和安全性，为实现转化医学及HCC精准自杀基因治疗提供理论依据和应用基础研究。第二方面，基于上述研究发现，本专利技术提供了前述系统在制备治疗肿瘤药物方面的应用。所述肿瘤优选为肝癌；所述药物特异性靶向肝癌HepG2细胞，因此针对肝癌HepG2细胞具有格外明显的促细胞凋亡效果。第三方面，本专利技术提供了含有上述系统的药物、试剂和试剂盒。即利用了上述系统的高特异性靶向肝癌细胞的特点，以及利用了上述系统的高效调控TK基因的表达的特点，而以药物、试剂或试剂盒的形式生产得到的产品，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。本专利技术的有益效果至少在于：本专利技术与以往肝细胞癌自杀基因治疗比较，眼于临床肝癌治疗效果不佳和晚期肝癌治疗方法匮乏，原创性整合现有成熟的病毒载体、基因敲除体系、特异性启动子驱动诱导肝癌细胞凋亡和模型动物抗癌效应。本专利技术利用rAAV缺乏自我复制能力和嗜肝细胞的特性，设计携载自杀基因系统的rAAV载体防范自杀基因治疗泛化；利用肝癌特异性启动子驱动Cre重组酶精准敲除，剪接LoxP序列中插入的Stop序列，调节下游TK基因表达，控制其高度选择性表达。本专利技术在既往肿瘤自杀基因理论基础上，将自杀基因置于含由转录终止序列的LoxP阅读窗的下游，依赖AFP驱动的Cre重组酶剪接方能转录表达、发挥抗癌效应，是自杀基因理论在特异性、调控性方面的创新进展。本专利技术与现有肿瘤基因治疗和细胞治疗等技术比较，利用分子生物学、细胞生物学和基因工程技术采用AFP、SURV双启动子分别驱动Cre-LoxP内切酶系统，高效性、特异性、可控性、安全性指导HCC治疗，是典型的细胞生物学和基因工程的的交叉学科研究，是转化医学的前期研究，也为肝细胞癌个体化精准医疗及临床肝癌治疗提供理论依据。附图说明图1为实施例1中所述的载体图谱，其中，A为rAAV-Survivin-LoxP-Stop-LoxP-TK载体；B为rAAV-AFP-Cre载体。图2为rAAV-AFP-Cre和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK操纵系统能驱动TK的表达。图3为rAAV-AFP-Cre和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK操纵系统能驱动TK的表达。图4为rAAV-AFP-Cre/rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控自杀基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵系统，其特征在于，所述系统包括：(1)由AFP启动子驱动表达的Cre重组酶基因；(2)由SURV启动子驱动表达的自杀基因；所述SURV启动子与所述自杀基因之间插入一段LoxP‑Stop‑LoxP序列，Stop为转录终止序列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列。

【技术特征摘要】
1.一种调控自杀基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵系统，其特征在于，所述系统包括：(1)由AFP启动子驱动表达的Cre重组酶基因；(2)由SURV启动子驱动表达的自杀基因；所述SURV启动子与所述自杀基因之间插入一段LoxP-Stop-LoxP序列，Stop为转录终止序列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述自杀基因为TK基因。3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于，所述系统包括两个rAAV载体：其一，含有HCC特异性表达的AFP启动子元件，以及可被AFP启动子驱动...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹卫龙，童畅，
申请(专利权)人：邹卫龙，
类型：发明
国别省市：北京,11