天冬氨酸激酶III突变体及其宿主细胞和应用制造技术

本发明专利技术提供一种天冬氨酸激酶，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基为非天冬氨酸。本发明专利技术的天冬氨酸激酶能高效解除L‑赖氨酸的反馈抑制，并且能有效用于生产L‑赖氨酸。本发明专利技术还提供包含编码所述天冬氨酸激酶的基因的宿主细胞以及利用所述宿主细胞或天冬氨酸激酶产生L‑赖氨酸的方法。本发明专利技术的天冬氨酸激酶或包含本发明专利技术天冬氨酸激酶的宿主细胞还用于产生L‑苏氨酸、L‑甲硫氨酸、L‑异亮氨酸或L‑缬氨酸。本发明专利技术还提供利用所述天冬氨酸激酶或宿主细胞产生L‑天冬氨酰‑4‑基磷酸的方法。

Aspartate kinase III mutant and its host cell and Application

The present invention provides an aspartate kinase whose amino acid residue corresponding to position 340 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is non-aspartate. The aspartate kinase of the invention can effectively relieve the feedback inhibition of L_lysine and can be effectively used for the production of L_lysine. The present invention also provides a host cell containing a gene encoding the aspartate kinase and a method for producing L_lysine using the host cell or the aspartate kinase. The aspartate kinase or the host cell containing the aspartate kinase of the present invention is also used for producing L threonine, L methionine, L isoleucine or L valine. The invention also provides a method for producing L_asparagine_4-phosphoric acid by using the aspartate kinase or the host cell.

【技术实现步骤摘要】
天冬氨酸激酶III突变体及其宿主细胞和应用本申请是2012年10月18日提交的，申请号为2012103989026，专利技术名称为“天冬氨酸激酶III突变体及其宿主细胞和应用”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及生物
具体地说，本专利技术涉及天冬氨酸激酶III(简称AKIII，又称LysC)的突变体及其应用。
技术介绍
L-赖氨酸是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸，在食品工业、养殖业和饲料工业中有着十分重要的地位。近年来，其市场需求稳步增加，世界市场销售量已经突破百万吨规模。目前，赖氨酸主要采用微生物发酵法来生产。在许多微生物中L-赖氨酸的合成途径是以天冬氨酸为前体的，包括两步和甲硫氨酸和苏氨酸等氨基酸共用的步骤。在大肠杆菌中，L-赖氨酸生物合成途径经过九步的酶催化过程(如下式所示)。其中，天冬氨酸激酶催化赖氨酸生物合成的第一步反应，是赖氨酸生产的限速步骤，它的活力决定着代谢流流向L-赖氨酸合成途径的比例。在大肠杆菌中有三个天冬氨酸激酶，分别命名为天冬氨酸激酶I(AKI，由thrA基因编码)、天冬氨酸激酶II(AKII，由metL基因编码)、天冬氨酸激酶III(AKIII，由lysC基因编码，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)。AKI和AKII是双功能酶，都还具有高丝氨酸脱氢酶活性。AKI在酶活性水平受到苏氨酸和赖氨酸的反馈抑制，AKIII在酶活性水平受终产物赖氨酸的反馈抑制(BearerCF,NeetKE；Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBras,G.,Robichon-Szulmajster,H.(1961)."Feed-backInhibitionandRepressionofAspartokinaseActivityinEscherichiacoliandSaccharomycescerevisiae."J.Biol.Chem.)。AKII在酶活水平不受天冬氨酸家族氨基酸的反馈抑制但是受到转录水平严谨调控(XDong,PJQuinn,XWang.(2011).“MetabolicengineeringofEscherichiacoliandCorynebacteriumglutamicumfortheproductionofL-threonine.”Biotechnologyadvances)。从天冬氨酸到L-赖氨酸的生物合成途径目前大肠杆菌已经被多家企业改造用来进行赖氨酸的工业化生产。由于天冬氨酸激酶活性收到赖氨酸严谨的调控，解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制是发展高产赖氨酸菌株的必经之路。杜邦公司通过随机突变筛选获得了两种解除反馈抑制的AKIII突变体，分别是将352苏氨酸用异亮氨酸替换(T352I)和318位甲硫氨酸用异亮氨酸替换(M318I)(EP1394257)。日本味之素公司也获得部分解除赖氨酸反馈抑制的AKIII突变体(US005661012、US2010190216、US2010173368)。此外，由于天冬氨酸激酶是L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-甲硫氨酸的合成途径所共用的酶，例如，中国专利CN1071378C公开了一种解除反馈抑制的天冬氨酸激酶以及利用该激酶和包含该激酶的宿主生产L-苏氨酸的方法。如果能够获得具有高比活和有效解除L-赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶，对于L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-甲硫氨酸，甚至以L-苏氨酸为前体合成的其他代谢物，包括L-异亮氨酸和L-缬氨酸的生产都具有重要的意义。因此，综上所述，本领域急需具有高酶活和有效解除L-赖氨酸反馈抑制天冬氨酸激酶突变体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供具有高酶活和解除L-赖氨酸反馈抑制的AKIII突变体以及此类突变体的应用与使用方法。在第一方面，本专利技术提供一种天冬氨酸激酶，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基为非天冬氨酸。在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶来源于埃希氏菌属细菌，优选地，来源于大肠杆菌。在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶：a.具有如SEQIDNO:2所示氨基酸序列且第340位的氨基酸残基为非天冬氨酸，或b.具有a)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的天冬氨酸激酶功能的由a)衍生的天冬氨酸激酶。在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基选自以下氨基酸的至少一种：Pro、Ala、Arg、Lys、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Met和Phe。在进一步优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基选自Pro、Arg或Val。在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶：a.其氨基酸序列如SEQIDNO:4、6或8所示；或b.包含(a)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a所限定的天冬氨酸激酶功能的由a衍生的天冬氨酸激酶。在进一步优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4、6或8所示。在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶解除赖氨酸反馈抑制。在另一优选的实施方式中，在10mM浓度的L-赖氨酸存在下，所述的天冬氨酸激酶至少保留20％以上的活性；优选地，30％-40％以上的活性；更优选地，50％-60％以上的活性；更优选地，70％-80％以上的活性；最优选，90％以上的活性。在进一步优选的实施方式中，所述的天冬氨酸激酶在20mM浓度的L-赖氨酸存在下，所述的天冬氨酸激酶至少保留20％以上的活性；优选地，30％-40％以上的活性；更优选地，50％-60％以上的活性；更优选地，70％以上的活性；最优选，80％以上的活性。在更进一步优选的实施方式中，所述的天冬氨酸激酶在100mM浓度的L-赖氨酸存在下，所述的天冬氨酸激酶至少保留20％以上的活性；优选地，30％-40％以上的活性；更优选地，50％-60％以上的活性；更优选地，70％以上的活性；最优选，80％以上的活性。在第二方面，本专利技术提供编码本专利技术第一方面所述天冬氨酸激酶的基因。在优选的实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3、5或7所示。在第三方面，本专利技术提供包含本专利技术第二方面所述编码基因的载体。在第四方面，本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术第二方面所述的编码基因。在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基选自以下氨基酸的至少一种：Pro、Ala、Arg、Lys、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Met和Phe。在进一步优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基选自Pro、Arg或Val。在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶：a.其氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种天冬氨酸激酶，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基为非天冬氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种天冬氨酸激酶，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基为非天冬氨酸。2.如权利要求1所述的天冬氨酸激酶，其特征在于，所述天冬氨酸激酶：a).具有如SEQIDNO:2所示氨基酸序列且第340位的氨基酸残基为非天冬氨酸，或b).具有由a)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的天冬氨酸激酶功能的由a)衍生的天冬氨酸激酶。3.如权利要求2所述的天冬氨酸激酶，其特征在于，b)所述的天冬氨酸激酶具有在a)所限定的序列两端的任一端进行一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的天冬氨酸激酶功能的由a)衍生的天冬氨酸激酶。4.如权利要求1所述的天冬氨酸激酶，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基选自以下氨基酸的至少一种：Pro、Ala、Arg、Lys、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Met和Phe；优选地，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基选自Pro、Arg或Val。5.如权利要求1-4中任一项所述的天冬氨酸激酶，其特征在于，所述天冬氨酸激酶：a).其氨基酸序列如SEQIDNO:4、6或8所示；或b).具有由a)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的天冬氨酸激酶功能的由a)衍生的天冬氨酸激酶。6.如权利要求5所述的天冬氨酸激酶，其特征在于，b)所述的天冬氨酸激酶具有在a)所限定的序列两端的任一端进行一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的天冬氨酸激酶功能的由a)衍生的天冬氨酸激酶。7.如权利要求5所述的天冬氨酸激酶，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4、6或8所示。8.如权利要求1-7中任一项所述的天冬氨酸激酶，其特征在于，所述天冬氨酸激酶解除赖氨酸反馈抑制；优选地，在10mM浓度的L-赖氨酸存在下，所述的天冬氨酸激酶至少保留20％以上的活性；优选地，30％-40％以上的活性；更优选地，50％-60％以上的活性；更优选地，70％-80％以上的活性；最优选，90％以上的活性；更优选地，所述的天冬氨酸激酶在20mM浓度的L-赖氨酸存在下，所述的天冬氨酸激酶至少保留20％以上的活性；优选地，30％-40％以上的活性；更优选地，50％-60％以上的活性；更优选地，70％以上的活性；最优选，80％以上的活性；最优选地，所述的天冬氨酸激酶在100mM浓度的L-赖氨酸存在下，所述的天冬氨酸激酶至少保留20％以上的活性；优选地，30％-40％以上的活性；更优选地，50％-60％以上的活性；更优选地，70％以上的活性；最优选，80％以上的活性。9.如权利要求1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳国君，孙际宾，郑平，刘娇，李庆刚，夏令和，周永生，罗虎，周勇，满云，卢宗梅，马延和，
申请(专利权)人：中粮生物化学安徽股份有限公司，中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34