亚硝化菌的保藏方法技术

本发明专利技术公开了一种亚硝化菌的保藏方法，包括以下步骤：1)配置保护剂：在90～120份无菌水中加入2～4份谷氨酸钠、18～25份磷酸三钾和1～3份半胱氨酸，混合均匀得到保护剂；2)加入菌体：在步骤1)得到的保护剂中加入0.8～1.2倍体积亚硝化菌菌体，震荡重悬，得到混合液；3)冷冻保藏：将步骤2)得到的混合液冷冻干燥，于‑70～‑90℃下冷冻保藏，每隔2～3个月进行活化转接。有益效果：可大幅减小冷冻干燥对亚硝化菌菌体的损伤，提高保藏过程中亚硝化菌存活率和ATP酶、氨单加氧酶(AMO)的活性。

Preservation of nitrosation bacteria

The invention discloses a method for preserving nitrosobacteria, which comprises the following steps: 1) disposing a protective agent: adding 2-4 phr of sodium glutamate, 18-25 phr of potassium phosphate and 1-3 phr of cysteine into 90-120 phr of aseptic water, mixing and evenly obtaining a protective agent; 2) adding a bacteria: adding 0.8-1.2 ploidy into the protective agent obtained in step 1; Nitrite accumulating bacteria were suspended to obtain mixed solution; 3) Cryopreservation: freeze-dried the mixed solution obtained in step 2, frozen at 820 Beneficial effect: It can greatly reduce the damage of freeze-drying to nitrosobacteria, improve the survival rate of nitrosobacteria and the activity of ATPase and AMO during storage.

【技术实现步骤摘要】
亚硝化菌的保藏方法
本专利技术涉及菌种保藏
，具体是一种亚硝化菌的保藏方法。
技术介绍
氨氮首先在亚硝化菌作用下转化为亚硝酸盐,然后在硝化菌作用下亚硝酸盐进一步转化为硝酸盐。硝化反应的总反应式为：NH4++1.815O2+0.1304CO2→0.0261C5H7O2+0.973NO3--N+0.921H2O+1.973H+。亚硝化菌氮循环的氧化代谢途径主要包括氨(NH3)通过氨单加氧酶(AMO)氧化为羟胺(NH20H)，羟胺在羟胺还原酶(HAO)催化作用下继续氧化为亚硝酸根。亚硝酸细菌在自然界中的分布普遍,土壤、海洋及淡水中都有亚硝酸细菌的存在,且只占其中细菌总量的极小的比例。不同种属的亚硝酸细菌所分布的环境也不同。如欧洲亚硝酸菌广泛分布于土壤、污水、新鲜水及海洋中；白里亚硝酸螺旋菌主要分布于土壤中；而海洋亚硝酸球菌只在海洋中存在。亚硝酸细菌的生长极为缓慢，在适宜的条件下需24h才能完成一次分裂周期。在进行固体培养的过程中一般需数月才能见到菌落生长。冷冻干燥技术是众多菌种保藏方法中在理想的方法之一，但是冻干对亚硝化菌细胞会造成一定的生理损伤，降低细胞存活率，主要表现在冻结过程中冰晶的机械损伤、冻结及干燥过程中引起的溶质损伤、冷冻干燥前后细胞膜的结构、功能及成分的变化、关键酶失活、DNA结构的变化等。(1)机械损伤:在干燥前，要将菌体进行冻结，在冻结的过程中，细胞内大量的水会形成冰晶，冰晶引起细胞膜的破裂，对细胞膜系统造成的机械损伤，导致膜结构的破坏，从而影响细胞正常的生理代谢功能；(2)溶质损伤:对于细胞来说其体积很小、比表面积很大、细胞膜的水渗透率很高，温度降低时细胞内水分含量下降，胞外和胞内的电解质浓缩，细胞过度脱水、严重皱缩；这些都导致细胞的损伤以至死亡；这种损伤被称为“溶液损伤”或“溶质损伤”；(3)细胞膜的结构及成分的变化:冷冻干燥是一个强烈的胁迫过程，在这个过程中必然造成细胞膜脂类物质的物理状态变化。细胞膜磷脂为双分子层，膜的两端为极性端，其在一定程度上是以水合形式存在的，每个磷脂的极性端之间被水隔开。当冷冻干燥脱水时，磷脂极性端除去水合氢键，迫使酰基集聚在一起，极性端密度变大，分子间范德华力增加，液晶相脂膜转变凝胶相，这种结构变化导致了细胞膜渗透性增加，使得细胞无法控制胞内外物质的双向交换，从而造成细胞的代谢损伤。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可大幅减小冷冻干燥对亚硝化菌菌体的损伤，提高亚硝化菌存活率和ATP酶、氨单加氧酶(AMO)的活性的亚硝化菌的保藏方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：亚硝化菌的保藏方法，包括以下步骤：1)配置保护剂：在90～120份无菌水中加入2～4份谷氨酸钠、18～25份磷酸三钾和1～3份半胱氨酸，混合均匀得到保护剂；2)加入菌体：在步骤1)得到的保护剂中加入0.8～1.2倍体积亚硝化菌菌体，震荡重悬，得到混合液；3)冷冻保藏：将步骤2)得到的混合液冷冻干燥，于-70～-90℃下冷冻保藏，每隔2～3个月进行活化转接。冷冻干燥前进行冷热胁迫处理：将得到的混合液于30～40℃恒温热处理10～20min，然后于4～8℃恒温处理1～2h。冷冻干燥工艺为：预冻：-40～-30℃预冻3～5h；冷冻干燥：-70～-60℃，30～50Pa冷冻干燥5～7h，-20～-10℃，60～100Pa冷冻干燥2～3h；升华干燥：5～15℃，100～200Pa升华干燥3～4h；解析干燥:10～20℃，3～5Pa解析干燥2～4h。为优化上述方案，本专利技术采取的措施为：1)配置保护剂：在90～120份无菌水中加入2～4份谷氨酸钠、18～25份磷酸三钾和1～3份半胱氨酸，混合均匀得到保护剂。谷氨酸钠、磷酸三钾和半胱氨酸三者有协同作用，在菌体冻结的过程中，可以显著的阻止冰晶的形成，稳定磷脂双分子层和膜蛋白结构，并且能保护细胞膜-ATP酶的活性，减少因冷冻或水分不断升华对亚硝化菌细胞所造成的损害；2)制备吸附载体：根据壳聚糖的阳离子性，明胶得到两性特点，以二者为原料，戊二醛为交联剂，通过反相悬浮交联法制备得到壳聚糖/明胶复合微球；3)加入菌体：在100～120份步骤1)得到的保护剂中加入30～50份步骤2)得到的壳聚糖/明胶复合微球和100～180份亚硝化菌菌体，震荡重悬，得到混合液。亚硝化菌菌体吸附在壳聚糖/明胶复合微球表面，增加了菌体密度，可提高亚硝化菌在饥饿环境下的存活时间。并且上述体系可诱导亚硝化菌菌体内不饱和脂肪酸的合成，增加膜脂质中不饱和脂肪酸的比例，显著降低冰晶形成和细胞内的渗透压对细胞膜的伤害，维持细胞膜的流动性、完整性、ATP酶(Mg2+ATPase，Ca2+ATPase，Na+-K+ATPase)的活性和氨单加氧酶(AMO)的活性，从而提高菌体的冷冻干燥抗性；4)冷热胁迫处理：将得到的混合液于30～40℃恒温热处理10～20min，然后于4～8℃恒温处理1～2h。亚硝化菌在冷胁迫和热胁迫的条件下会产生一些低分子量的应激蛋白，在冷胁迫条件下产生的应激蛋白被称为冷诱导蛋白，冷休克蛋白；在热胁迫条件下产生的应激蛋白被称为热休克蛋白。冷休克蛋白和热休克蛋白有分子伴侣的作用，可改善细胞膜的流动性、有效提高蛋白的正确折叠，改善亚硝化菌对冷冻干燥的抵抗力，减小冻干对菌体的损伤。并且还能在-70～-90℃低温条件下有效调节DNA的翻译和转录过程，大幅降低亚硝化菌的突变概率，保留原有的优良性能；5)冷冻保藏：将步骤4)得到的混合液冷冻干燥，于-70～-90℃下冷冻保藏，每隔8～12个月进行活化转接。本专利技术优化后方案提高了亚硝化菌细胞膜的流动性、完整性、ATP酶(Mg2+ATPase，Ca2+ATPase，Na+-K+ATPase)的活性和氨单加氧酶(AMO)的活性，并且减少了菌种活化转接次数，更好地保留了亚硝化菌的优良性能。作为优选，吸附载体的具体制备步骤为：将1～3份壳聚糖溶于80～100份2～4％的醋酸溶液中，搅拌溶解后加入40～50份18～25g/mL明胶溶液，混合搅拌均匀得到水相；将1～4份液体石蜡和1～4份表面活性剂span-80混合，在均匀搅拌条件下加热到50～65℃，得到油相；将油相加入到水相，乳化15～30min后降温，当温度降到15℃以下，加入1～2份40～55％戊二醛进行交联固化，0.8～1.5h后结束反应。产物在800～1500r/min条件下离心5～10min，后，用丙醇、异丙醇分别润洗，直到液体石蜡洗净为止，最后干燥得到壳聚糖/明胶复合微球。作为优选，冷冻干燥工艺为：预冻：-40～-30℃预冻3～5h；冷冻干燥：-70～-60℃，30～50Pa冷冻干燥5～7h，-20～-10℃，60～100Pa冷冻干燥2～3h；升华干燥：5～15℃，100～200Pa升华干燥3～4h；解析干燥:10～20℃，3～5Pa解析干燥2～4h。上述冷冻干燥温度下，冻结速度与亚硝化菌细胞对水分的渗透率相平衡。如果冷冻速度过快，细胞内的水分来不及渗出，截留在细胞内部，会形成大量的冰晶，对细胞膜造成机械损伤；如果冻结速度过慢，细胞内的水分大量的渗出，细胞内的离子浓度上升过高，引起溶质效应，造成细胞内敏感蛋白的失活，影响细胞的活力。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1.通过冷热胁迫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.亚硝化菌的保藏方法，其特征在于包括以下步骤：1)配置保护剂：在90～120份无菌水中加入2～4份谷氨酸钠、18～25份磷酸三钾和1～3份半胱氨酸，混合均匀得到保护剂；2)加入菌体：在步骤1)得到的保护剂中加入0.8～1.2倍体积亚硝化菌菌体，震荡重悬，得到混合液；3)冷冻保藏：将步骤2)得到的混合液冷冻干燥，于‑70～‑90℃下冷冻保藏，每隔2～3个月进行活化转接。

【技术特征摘要】
1.亚硝化菌的保藏方法，其特征在于包括以下步骤：1)配置保护剂：在90～120份无菌水中加入2～4份谷氨酸钠、18～25份磷酸三钾和1～3份半胱氨酸，混合均匀得到保护剂；2)加入菌体：在步骤1)得到的保护剂中加入0.8～1.2倍体积亚硝化菌菌体，震荡重悬，得到混合液；3)冷冻保藏：将步骤2)得到的混合液冷冻干燥，于-70～-90℃下冷冻保藏，每隔2～3个月进行活化转接。2.根据权利要求1所述的亚硝化菌的保藏方法，其特征在于：所述的冷冻干燥...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤江武，孙宏，李园成，吴逸飞，姚晓红，王新，沈琦，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33