一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征是：将多个带搅拌器的圆柱形容器串联形成自然流动方式，在各容器中放置提前平衡后的凝胶，某一批次待处理血浆存放在第一个容器上方；先定量注入第一个容器中，凝胶搅拌吸附一个单元时间后，再从以一定流量速度放出吸附后的血浆到第二个容器中，与此同时，其它待处理血浆再以相同流量速度流入第一个吸附罐中，即保持第一个容器中的血浆量动态平衡，这时，在第一个容器内血浆的吸附和分离是同时进行的；以此类推，血浆全部通过后，关闭各容器的出口，分别对凝胶进行洗涤、洗脱。这样血浆量不受容器体积限制，易于过程控制并且FⅨ活性回收率较高，无凝胶泄漏和交叉污染的风险。

【技术实现步骤摘要】
一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺
本专利技术涉及一种人凝血酶原复合物的制备工艺，属于生物制药领域，尤其涉及一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺。
技术介绍
人凝血酶原复合物（ProthrombinComplexConcentrate，PCC）是从健康人混合血浆中分离制备的一种能促进血液凝固的静脉注射血浆蛋白制剂，泛称因子IX浓制剂。PCC主要含有依赖于维生素K的凝血酶原（FⅡ）、稳定因子（FⅦ）、血浆凝血活酶成分（FⅨ）和Stuart-Prower因子（FⅩ）。PCC中各种凝血因子蛋白的血浆浓度在1~200mg/L之间，它们都属丝氨酸蛋白酶，在血液循环中均以无活性的酶原形式存在。由于这些因子都属于糖蛋白，都在肝脏合成，并由维生素K介导，其理化性质（分子质量、等电点等）极为相似，故在规模化生产中用一般的理化方法很难将其分开，商品PCC几乎都含有上述四种凝血因子。据世界卫生组织（WHO）和世界血友病联盟（WHF）报告，全球乙型血友病（HB）的发病率约（1.0～1.5）人/10万人，占血友病的15%～20%。目前我国HB患者约为2万人。替代治疗是目前唯一有效地制止HB患者出血的方法。在国内没有高纯的Ⅸ因子浓缩物的情况下，PCC仍然是治疗乙型血友病的主要制品（本申请人在现有PCC的工艺基础上正在积极开发高纯Ⅸ因子制剂）。如果采用为患者定期输注浓缩凝血因子的预防疗法，即使是重度的血友病患者，也可以过上几乎和正常人一样的生活，但目前全世界尚80％患者没有任何替代治疗。血浆制品的产率仅5％~10％，截止目前国内已有5家血液制品企业获得PCC的生产批件，仅有3家企业有上市的PCC制品。由于PCC的匮乏与昂贵，中国的患者很难承受这种预防疗法，只能在发生出血后输注浓缩凝血因子。故PCC制剂为临床急需、市场短缺的药品之一。目前，国内外PCC的分离纯化技术主要为批式的离子交换吸附法，即将离子交换树脂加入血浆中（比例为：1~1.5g干胶/L血浆）搅拌吸附一段时间，随后分离出离子交换树脂并转移到层析柱中，经过洗涤和洗脱得到PCC蛋白液。批式吸附法必需是在搅拌罐内进行吸附，由于凝胶机械强度差而易破碎；洗涤和洗脱需转移到层析柱内完成，操作麻烦，劳动强度大，易产生交叉污染且周期较长；血浆处理量受到限制。现有技术虽然有所进步，但仍然难于脱离传统分离纯化技术，只是在个别工艺进行优化如：ZL201010534827.2《一种人凝血酶原复合物的制备工艺》，其制备工艺包括对血浆进行吸附、洗涤、洗脱及澄清过滤；病毒灭活（S/D法）；再吸附纯化；分装；冻干；干热灭活；该专利技术采取凝胶直接从血浆吸附人凝血酶原复合物，在提取整个过程只用凝胶层析技术，简化了生产步骤，减少了各种因素对产品生产过程中的污染，同时产品的得率提高25-30%。此外生产过程中采用S/D法去除脂包膜病毒及99.5±0.5℃干热法去除非脂包膜病毒，经过这2次病毒灭活步骤显著提高了临床用药的安全性。ZL201110030793.8《一种人凝血酶原复合物的生产方法》，其制备工艺包括采用从血浆中直接分离提取，病毒灭活，精制，二次病毒灭活，即得人凝血酶原复合物成品。本专利技术采用从血浆中直接分离提取，分离条件温和，产品的批间差异小，凝血因子活性稳定，收获率高，且基本没有激活现象发生。病毒灭活工艺采用S/D法和干热灭活法相结合的方法，充分保证了产品的病毒安全性。ZL201410340403.0《一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法》，其制备工艺包括（1）去除冷沉淀血浆，使用预先经EDTA溶液和枸橼酸钠溶液清洗过的纤维素深层滤板过滤（2）深层过滤后的血浆在固定床上样时经过0.2μm的滤芯膜在线过滤；（3）装填有阴离子交换凝胶CaptoDEAE的固定床层析柱使用缓冲液A平衡2~5个柱体积，血浆上样流速为60~120cm/h，用缓冲液B洗涤层析柱，用缓冲液C洗脱层析柱，得到PCC制品，按照凝血因子IX计算，PCC的收率可以达到75%~90%，比活性可以达到5.5IU/mg以上。ZL201210098844.5《一种高收率人凝血酶原复合物的制备方法》，其制备工艺包括化浆、调整蛋白浓度和pH值、凝胶吸附、洗涤、洗脱、稀释调整蛋白浓度和离子强度、S/D病毒灭活、再凝胶吸附、再洗涤、洗脱、超滤、除菌分装、冻干、干热灭活工艺步骤，调整蛋白浓度和pH值时，将去除冷沉淀、澄清过滤的血浆用2-8℃0.9%生理盐水调整蛋白浓度至3.0-5.0%，然后用醋酸-醋酸钠缓冲液调pH值至6.8-7.2。本专利技术与现有技术相比，具有工艺简单、安全性高、产品收率高、比活高等特点，产品收率达到45.28±2.26万IU(以IX因子效价计算)/吨血浆，比活达到0.87±0.12IU/mg。由于，PCC除了用于治疗乙型血友病外，还可以用于治疗先天性和获得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏症包括：1、凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏症；2、抗凝剂过量、维生素K缺乏症；3、因肝病导致的凝血机制紊乱；4、各种原因所致的凝血酶原时间延长而拟作外科手术患者；5、治疗已产生因子Ⅷ抑制物的甲型血友病患者的出血症状。6、逆转香豆素类抗凝剂诱导的出血。随着我国肝炎发病率的增加，以及临床医师对人凝血酶原复合物（PCC）制剂治疗效果的认同，同时PCC在临床上具有广泛的适应症，临床上需求量大，市场前景良好。因此，对PCC的分离纯化技术做进一步探索就显得迫在眉睫，意义重大。
技术实现思路
为克服现有技术中的缺点，本专利技术在传统的批式吸附法制备PCC的基础上，创造性地发展为一种流动式吸附的方法制备PCC。该法将血浆和凝胶置于四个带搅拌器的圆柱形容器内，在容器上方以一定速率注入血浆同时在容器下方以一定速率放出吸附后的血浆，即血浆的吸附和分离是同时进行的；血浆全部通过后凝胶无需转移即可进行洗涤、洗脱；相比批式吸附法，流动吸附法处理血浆量不受容器体积限制，易于过程控制并且FⅨ活性回收率较高。同时对现有技术进一步优化，在国内外PCC的制备工艺中，通常只使用一种离子交换凝胶进行吸附，如DEAESephadexA50凝胶。该方法制备出的PCC比活性一般不会高于1.0IU/mg蛋白，纯度相对较低。在S/D法病毒灭活后，本专利技术采用CaptoDEAE离子交换层析，不仅能有效清除S/D试剂，能更有效的去除杂蛋白，提高产品纯度；另外针对临床上使用PCC可能会导致血栓的发生风险，本专利技术在PCC分装前配制过程中加入肝素钠及抗凝血酶-Ⅲ（AT3），可以大大降低PCC在使用时血栓的发生，提高临床PCC使用的安全性；再则为什么国内血液制品生产企业至少拥有20家，而真正拥有上市PCC制品的仅3家呢。主要问题在于该制品在冻干后再复溶可见异物难以控制，容易导致不合格制品，本专利技术制品在冷冻干燥过程中，预冻步骤采用快速冻结制品，有利于制品形成细小的晶体，保持制品原有属性，较少预冻机械应力对制品的破坏，提高制品的合格率。综上分析，本专利技术的目的是提供一种流动式吸附制备人凝血酶原复合物的工艺，通过采用两步层析法及两步病毒灭活法，制备得到人凝血因子Ⅸ效价为16~24IU/ml，人凝血因子Ⅸ比活性在2.0IU/mg蛋白以上，人凝血因子Ⅸ收得率在50%以上的人凝血酶原复合物。本专利技术的目的是这样实现的：以健康人血浆为原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征是制备工艺如下：将多个带搅拌器的圆柱形容器串联形成自然流动方式，在各容器中放置提前平衡后的凝胶，某一批次待处理血浆存放在第一个容器上方；先将部分待处理血浆流动注入第一个容器内，定量后停止注入，凝胶对注入的定量血浆进行搅拌吸附，搅拌吸附一个单元时间后，再从第一个容器下方以一定流量速度放出吸附后的血浆，经第二个容器的上方流入第二个容器中，与此同时，存放在第一个容器上方的其它待处理血浆再以相同流量速度流入第一个吸附罐中，即保持第一个容器中的血浆量动态平衡，这时，在第一个容器内血浆的吸附和分离是同时进行的；当流入第二个容器的血浆达到定量后，再从第二个容器下方以相同的流量速度流入第三个容器中，保持第二个容器中的血浆量动态平衡；以此类推，保持之后的各容器中的血浆量动态平衡，在最后一个容器完成血浆凝胶流动式吸附过程；各容器血浆全部通过后，关闭各容器的出口，分别对凝胶进行洗涤、洗脱；收集洗脱蛋白液①；再进行后续处理；凝胶用量根据该批次待处理血浆量、容器串联数量、单元时间和流量速度而定，流量速度以保证血浆在各容器中的时间大于等于一个单元时间。

【技术特征摘要】
1.一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征是制备工艺如下：将多个带搅拌器的圆柱形容器串联形成自然流动方式，在各容器中放置提前平衡后的凝胶，某一批次待处理血浆存放在第一个容器上方；先将部分待处理血浆流动注入第一个容器内，定量后停止注入，凝胶对注入的定量血浆进行搅拌吸附，搅拌吸附一个单元时间后，再从第一个容器下方以一定流量速度放出吸附后的血浆，经第二个容器的上方流入第二个容器中，与此同时，存放在第一个容器上方的其它待处理血浆再以相同流量速度流入第一个吸附罐中，即保持第一个容器中的血浆量动态平衡，这时，在第一个容器内血浆的吸附和分离是同时进行的；当流入第二个容器的血浆达到定量后，再从第二个容器下方以相同的流量速度流入第三个容器中，保持第二个容器中的血浆量动态平衡；以此类推，保持之后的各容器中的血浆量动态平衡，在最后一个容器完成血浆凝胶流动式吸附过程；各容器血浆全部通过后，关闭各容器的出口，分别对凝胶进行洗涤、洗脱；收集洗脱蛋白液①；再进行后续处理；凝胶用量根据该批次待处理血浆量、容器串联数量、单元时间和流量速度而定，流量速度以保证血浆在各容器中的时间大于等于一个单元时间。2.根据权利要求1所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，后续处理过程中，在S/D法病毒灭活后，采用CaptoDEAE离子交换层析，能有效清除S/D试剂，能更有效的去除杂蛋白，提高产品纯度；在人凝血酶原复合物（PCC）分装前配制过程中加入肝素钠及AT3，大大降低PCC在使用时血栓的发生；制备出人凝血因子Ⅸ效价为16~24IU/ml，人凝血因子Ⅸ比活性在2.0IU/mg蛋白以上，人凝血因子Ⅸ收得率在50%以上的人凝血酶原复合物。3.根据权利要求1或2所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，以健康人血浆为原料，经低温离心法去除冷沉淀，去冷沉淀血浆经DEAESephadexA50凝胶流动式吸附，洗涤、洗脱步骤得到人凝血酶原复合物（PCC）；再进行超滤脱盐、S/D法病毒灭活、去S/D试剂、CaptoDEAE离子交换层析、超滤浓缩透析得到精制人凝血酶原复合物原液；再经稀配、除菌过滤、分装、冷冻干燥、99~100℃干热灭活30min、包装、入库；制备得到人凝血因子Ⅸ效价为16~24IU/ml，比活性在2.0IU/mg蛋白以上，人凝血因子Ⅸ收得率在50%以上的人凝血酶原复合物。4.根据权利要求3所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，得到人凝血酶原复合物原液后，根据Ⅸ因子效价检测结果，按制品最终Ⅸ因子效价22~24IU/ml使用透析液②进行配制，使最终制品Ⅸ因子效价不小于20IU/ml；根据人凝血因子Ⅸ效价添加肝素钠及抗凝血酶-Ⅲ（AT3）；每100IU人凝血因子Ⅸ的肝素含量为20IU，AT3含量为4IU；得到人凝血酶原复合物稀配液。5.根据权利要求3所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，制品在冷冻干燥过程中采用如下冻干方法：①制品-40℃以下入柜，保持5小时；②开真空泵使真空度达到0.1mbar稳定；③2小时内隔板升温到-20℃，保持3小时；④3小时隔板升温到3℃，保持25小时；⑤4小时隔板升温到不超过35℃，保持8小时；⑥1小时使真空到0.05mbar以下，保持1小时以上；⑦压塞出柜；冻干后制品采用水浴灭菌柜，进行99~100℃，30min干热灭活病毒，降温至35℃以下后出柜；真空检测，放入待检品库。6.根据权利要求3所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，健康人血浆融化后，低温离心，收集去冷沉淀血浆；去冷沉淀血浆用20~30℃的循环水进行夹层循环加热，控制血浆温度在10~20℃；使用pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液调节血浆pH值为7.0±0.2。7.根据权利要求1或2所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁小明，张猛，何淑琴，张忠兵，黄璠，刘敏亮，
申请(专利权)人：博雅生物制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36