吊兰根系硝酸盐转运蛋白CcNPF8.3.1及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种吊兰根系硝酸盐转运蛋白CcNPF8.3.1及其编码基因与应用。本发明专利技术从吊兰根部中克隆了一个硝酸盐转运蛋白的编码基因CcNPF8.3.1，并将该基因导入△ynt‑Leu双突变多形汉逊酵母中，得到转CcNPF8.3.1酵母。通过试验证明：CcNPF8.3.1蛋白具有硝酸盐转运蛋白的功能，能提高植物的氮素利用效率，使植物快速生长。

Nitrate transporter CcNPF8.3.1 and its coding genes in Chlorophytum Chlorophytum and its application

The invention discloses a Chlorophytum nitrate transport protein CcNPF8.3.1 of Chlorophytum Chlorophytum, and its coding gene and application. The invention clones a nitrate transporter coding gene CcNPF 8.3.1 from the root of Cephalotaxus pendula, and transfers the gene into ynt_Leu double mutant Hansen yeast to obtain CcNPF 8.3.1 yeast. The results showed that CcNPF 8.3.1 protein had the function of nitrate transporter, which could improve the nitrogen use efficiency of plants and make plants grow rapidly.

【技术实现步骤摘要】
吊兰根系硝酸盐转运蛋白CcNPF8.3.1及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种吊兰根系硝酸盐转运蛋白CcNPF8.3.1及其编码基因与应用。
技术介绍
氮素是植物生长发育所必须的基本营养元素，在植物生长发育和形态建成中起着重要作用，其对作物的生命活动和产量形成也具有重要意义。硝酸盐(NO3-)是大多数作物最主要的氮源，硝酸盐供应量不足会严重抑制作物的生长发育。生理学研究表明，植物从土壤中吸收NO3-需有一整套高-和低-亲和力NO3-转运系统参加，NO3-的进入由跨质膜的H+梯度驱动。有些NO3-转运系统是组成型表达，有的则受NO3-诱导，且随着NO3-的同化呈负反馈调控。吊兰属百合科多年生常绿草本植物。其根系在水中蔓延生长，生长迅速，根系发达，茂密浓郁。在适宜的环境条件下快速蓬勃生长。仅仅用两天能够长出一个侧根。在过去几十年中，多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha，又称Pichiaangusta)已经成为一种公认的模式生物。广泛应用于研究甲醇代谢、硝酸盐吸收机制等。在多形汉逊酵母中，所有与硝酸盐代谢相关的基因紧密地排列成基因簇，总长1040bp的DNA片段中大约92％为编码DNA。多形汉逊酵母可以同化硝酸盐并把硝酸盐作为唯一氮源，它只有一个高亲和硝酸盐转运蛋白(nitratetransporters,Ynt1)，可以转运硝酸盐但是不能转运氯酸盐。YNT1结构上属于NNP(nitrate-nitriteporter)家族并且受到硝酸盐和亚硝酸盐的诱导。汉逊酵母基因YNT1,YNR1和YNI1分别编码硝酸盐转运蛋白、硝酸盐还原酶(nitratereductase),亚硝酸盐还原酶(nitritereductase)，它们的表达受硝酸盐和亚硝酸盐诱导并受按盐和谷氨酸抑致。YNT1缺失突变(ynt1)可以导致菌株在硝酸盐浓度低于500μM的条件下不能转运或生长。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种吊兰根系硝酸盐转运蛋白CcNPF8.3.1及其编码基因与应用。本专利技术提供了一种蛋白质，克隆自吊兰，命名为CcNPF8.3.1，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有硝酸盐转运功能的由序列5衍生的蛋白质。为了使(a1)中的CcNPF8.3.1蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a2)中的CcNPF8.3.1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的CcNPF8.3.1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述CcNPF8.3.1蛋白的基因(CcNPF8.3.1基因)也属于本专利技术的保护范围。所述基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：(b1)序列表中序列4所示的DNA分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码具有硝酸盐转运功能的蛋白的DNA分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有硝酸盐转运功能的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有CcNPF8.3.1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体具体可为将载体pYNR-LEU2的多克隆位点(具体可为salⅠ和speⅠ酶切位点)之间的片段替换为序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的表达载体。本专利技术还保护CcNPF8.3.1蛋白在转运硝酸盐中的应用。本专利技术还保护CcNPF8.3.1蛋白或CcNPF8.3.1基因在调控生物硝酸盐吸收速率中的应用。本专利技术还保护CcNPF8.3.1蛋白或CcNPF8.3.1基因在调控生物硝酸盐转运功能中的应用。本专利技术还保护一种培育转基因生物的方法，是将CcNPF8.3.1基因导入目的生物中，得到转基因生物；所述转基因生物硝酸盐转运功能高于所述目的生物。本专利技术还保护一种提高生物硝酸盐转运功能的方法，是增加目的生物中CcNPF8.3.1蛋白的表达量和/或活性，提高生物硝酸盐转运功能。本专利技术还保护CcNPF8.3.1蛋白，或，CcNPF8.3.1基因，或，以上任一所述的方法，在生物育种中的应用。所述生物育种的目的是为了选育硝酸盐转运功能高的生物。以上任一所述生物具体可为植物，更具体可为吊兰。以上任一所述生物具体可为酵母，更具体可为△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母。本专利技术从吊兰根部中克隆了一个硝酸盐转运蛋白的编码基因CcNPF8.3.1，并将该基因导入△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母中，得到转CcNPF8.3.1酵母。通过试验证明：CcNPF8.3.1蛋白具有硝酸盐转运蛋白的功能，能提高植物的氮素利用效率，使植物快速生长。附图说明图1为硝酸盐转运蛋白基因鉴定图。图2为3’RACE鉴定图。图3为5’RACE鉴定图。图4为转基因酵母△ynt-CcNPF8.3.1的鉴定图。图5为CcNPF8.3.1蛋白功能验证。图6为CcNPF8.3.1的硝酸盐吸收速率图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。吊兰：购自花鸟鱼市场。△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母：参考文献：TobaccoNia2cDNAfunctionallycomplementsaHansenulapolymorphayeastmutantlackingnitratereductase.Anewexpressionsystemforthestudyofplantproteinsinvolvedinnitrateassimilation.；公众可以从中国农业科学院生物技术研究所获得。载体pYNR-LEU2：参考文献：TobaccoNia2cDNAfunctionallycomplementsaHansenulapolymorphayeastmutantlackingnitratereductase.Anewexpressionsystemforthestudyofplantproteinsinvolvedinnitrateassimilation.；公众可以从中国农业科学院生物技术研究所获得。野生型汉逊酵母(WT)：参考文献：TobaccoNia2cDNAfunctionallycomplementsaHansenulapolymorphay本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有硝酸盐转运功能的由序列5衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有硝酸盐转运功能的由序列5衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：(b1)序列表中序列4所示的DNA分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码具有硝酸盐转运功能的蛋白的DNA分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有硝酸盐转运功能的蛋白的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昱辉，朱思慧，李梅，谭杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11