细菌快速试验制造技术

本发明专利技术涉及用于定量地测定细菌的方法和装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细菌快速试验本专利技术涉及用于定量地测定细菌的方法和装置。军团菌属于革兰氏阴性细菌类别。关于其增殖的最佳条件是在水中在25-50℃的温度范围内。它们可以存在于用于热水产生和分配的设备中，存在于具有长的停用时间的游泳池、用于空调设备的空气净化器、冷却塔、水箱和水管中。吸入以气溶胶形式的含军团菌的水，例如在淋浴的情况下、在空调设备的情况下、通过草地喷水器或在涡流式沐浴器中，可以在人中导致感染，其可以引起一种危险的、在多数情况下致命的疾病，“军团菌病”。因此，德国饮用水条例规定了对于军团菌的定期检验义务，这涉及具有用于饮用水加热的大型设备的饮用水设施的所有者，如果从该饮用水设施给出水并且与此同时发生其雾化，例如在淋浴中。该规定尤其适用于医院、学校、幼儿园、旅馆和护养院。这些机构有义务每年一次进行对于军团菌的检验。最近以来，多户住宅的业主或房东、住房建筑公司和物业管理部门也必须以各自三年的间隔进行相应的检验。在饮用水条例中，对于军团菌规定了100个菌落形成单位(CFU)/100ml的技术措施值。如果在检验时确定超过了该值，那么必须立即向主管卫生局报告。检验义务范围内的分析借助于常规的微生物学检测方法来进行。将待检验的饮用水样品在实验室中分配开，并且以两份平行的批料按照ISO11731(1998)和DINENISO11731-2(2008)进行检验。将起始样品的一部分作为直接批料和将另一部分在过滤后涂布在具有琼脂培养基的培养皿中。将来自所述两种批料的琼脂平板在36±2℃的恒定温度下在培养箱中温育十天。然后，对在温育期间生长处的军团菌菌落进行计数和评价。定量结果以关于100ml样品而言的“菌落形成单位(CFU)”来给出。为了证实独特的军团菌菌落，将至少五个菌落不仅在含半胱氨酸的培养基上而且还在不含半胱氨酸的培养基上平行地传代培养至少两天。由于氨基酸半胱氨酸对于军团菌来说是必需的，如果菌落在含半胱氨酸的培养基上生长，但在不含半胱氨酸的培养基上不生长，那么该检测被认为得到证实。上面所提及的分析的一个缺点在于，所述微生物学检测方法是昂贵的和耗时的。所述方法的另一个缺点在于，由此获得的结果具有在大约15％和35％之间的不准确性。因此，作为本专利技术基础的任务在于，提供经改善的用于定量地测定军团菌和其他细菌的方法，其中可以至少部分地避免现有技术的缺点。特别地，所述方法应当允许具有高精确性的明显更快速的测定。为了解决该任务，提供了新的用于定量地检测细菌的方法和装置。本专利技术基于测量经标记的细菌，其中所获得的测量信号与在样品中存在的细菌的总数目相关。细菌的检测可以例如通过发光辐射、荧光辐射或拉曼辐射来进行。本专利技术的第一个方面涉及用于定量地测定样品中的细菌的方法，其包括下列步骤：(a)将待检验的样品与能与待测定的细菌相结合的标记试剂一起进行温育，所述标记试剂优选地选自荧光标记试剂、发光标记试剂和拉曼标记试剂，(b)通过对于所述待测定的细菌来说不可渗透而对于所述标记试剂来说可渗透的膜，从细菌上去除未与细菌相结合的标记试剂，其中所述待测定的细菌被收集在所述膜上，(c)测定与所收集的细菌相结合的标记试剂，优选地通过发光测量、荧光测量和/或拉曼测量，和(d)定量地评价来自步骤(c)的测量信号。根据本专利技术的方法允许快速地且定量地测定样品中的细菌。所述方法可以在取样后直接进行，而无需事先培养待测定的细菌。对于标记试剂与细菌结合来说所需的温育时间优选地在一秒钟至最大五分钟，特别优选地直至最大2.5分钟的范围内。这导致，可达到少于十分钟，优选地少于五分钟的总测量时间。优选地，所述方法用于定量地测定军团菌。然而，也可以测定其他细菌，特别是人致病细菌，例如沙门氏菌，利斯特氏菌，大肠病菌例如大肠杆菌(E.coli)，例如EHEC，或医院病菌例如MRSA。其中对细菌进行测定的样品可以是拭子样品或水样品，但是也可以是生物学样品，例如来自肉类产品、乳产品或蛋类产品的食物样品，或体液例如血液、血浆、血清、尿等。通过根据本专利技术的方法的细菌测定通过使用能与待测定的细菌相结合的标记试剂并且测量来自与细菌相结合的标记试剂的信号来进行。所述测定可以例如通过发光测量、荧光测量和/或测量拉曼辐射(例如借助于表面增强拉曼光谱学(SERS))来进行。在此情况下，使用能与待测定的细菌相结合的标记试剂，优选地荧光的、发光的或具有拉曼活性的标记试剂，其对于待测定的细菌来说是选择性的，即识别在样品的其他组成部分中不存在的、在待测定的细菌上或内的结构。例如，所述标记试剂可以选自经标记的核酸探针、抗体、噬菌体及其组合。优选地，所述标记试剂为经标记的噬菌体。在一个实施方案中，可以使用荧光或发光的标记试剂，其发射例如在200nm至10μm，特别地200nm至2μm的范围内的荧光辐射或发光辐射。特别优选的发射波长在1300-1500nm的范围内。用于与互补的细菌核酸序列进行杂交的经荧光或发光标记的核酸探针原则上是已知的，并且例如用于FISH-技术。所述核酸探针通常是基于脱氧核糖核苷酸类似物和/或核酸类似物例如LNA-构件的探针。它们可以例如针对对于待检测的细菌来说特异的核糖体RNA序列和/或DNA序列。还已知针对对于待检测的细菌来说特异的抗原(例如存在于细菌表面上的抗原)的经标记的抗体，例如经荧光或发光标记的抗体，即多克隆或单克隆抗体以及抗体片段或抗体衍生物。在另一个特别优选的实施方案中，所述标记试剂可以为噬菌体，其携带标记，例如荧光标记或发光标记，并且特异性地识别在待测定的细菌上的表面结构。用于军团菌的噬菌体例如在Lammetyn(Microb.Ecol.56(2000),191-197)中作了描述。用于沙门氏菌的噬菌体例如在Atterbury等人(Appl.Environ.Microbiol.73(2007),4543-4549)、Wichard等人(J.FoodProt2(2003),178-340)或deLappe等人(J.Med.Microbiol.58(2009))中作了描述。利斯特氏菌的噬菌体例如在Klumpp&Loessner(www.Ncbi.Nlm.nih.gov>PMC3827098)中作了描述。用于MRSA的噬菌体例如在Sahin等人(Mikrobiol.Bul.47(2013),27-34)中作了描述。用于大肠杆菌的噬菌体，例如T-噬菌体、λ-噬菌体等在Sambrook等人(MolecularCloning,ALaboratoryManual)中作了描述。对于根据本专利技术的方法，使用经标记的噬菌体，例如经荧光或发光标记的噬菌体，优选地以相对于待检测的细菌而言过量。可以以大约107-109个噬菌体/批料来使用它们。通常发现，在这些条件下，每个细菌细胞配备有大约50-400个噬菌体，特别地大约50-250或50-150个噬菌体。例如，一个大肠杆菌细菌细胞可以配备有大约70个噬菌体。在另一个优选的实施方案中，可以使用通过拉曼光谱学可检测的标记试剂，例如包含表面增强的具有拉曼光谱学活性的颗粒的标记试剂。这些标记试剂优选地包含金属颗粒，例如金或银颗粒和/或拉曼报道分子，其结合至能与待检测的细菌相结合的探针。所述拉曼报道分子可以例如选自异硫氰酸酯染料或多硫荧光染本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于定量地测定样品中的细菌的方法，其包括下列步骤：(a)将待检验的样品与能与待测定的细菌相结合的标记试剂一起进行温育，所述标记试剂优选地选自荧光标记试剂、发光标记试剂和拉曼标记试剂，(b)通过对于所述待测定的细菌来说不可渗透而对于所述标记试剂来说可渗透的膜，从细菌上去除未与细菌相结合的标记试剂，其中所述待测定的细菌被收集在所述膜上，(c)测定与所收集的细菌相结合的标记试剂，优选地通过荧光测量、发光测量和/或拉曼测量，和(d)定量地评价来自步骤(c)的测量信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.17 EP 15181240.11.用于定量地测定样品中的细菌的方法，其包括下列步骤：(a)将待检验的样品与能与待测定的细菌相结合的标记试剂一起进行温育，所述标记试剂优选地选自荧光标记试剂、发光标记试剂和拉曼标记试剂，(b)通过对于所述待测定的细菌来说不可渗透而对于所述标记试剂来说可渗透的膜，从细菌上去除未与细菌相结合的标记试剂，其中所述待测定的细菌被收集在所述膜上，(c)测定与所收集的细菌相结合的标记试剂，优选地通过荧光测量、发光测量和/或拉曼测量，和(d)定量地评价来自步骤(c)的测量信号。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述细菌选自军团菌，沙门氏菌，利斯特氏菌，大肠病菌例如大肠杆菌(E.coli)，医院病菌例如MRSA。3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述标记试剂选自经标记的核酸探针、抗体、噬菌体及其组合。4.根据权利要求1至3之一的方法，其特征在于，作为标记试剂，使用经标记的噬菌体，优选地经荧光、发光或拉曼标记的噬菌体。5.根据权利要求1至4之一的方法，其特征在于，使用测量池用于进行测量，所述测量池包括：(i)第一室，其任选地包含关于所述标记试剂的储库，(ii)第二室，和(iii)膜，其被布置在所述第一室和所述第二室之间，其中所述膜对于待测定的细菌来说是不可渗透的而对于未与待测定的细菌相结合的标记试剂来说是可渗透的，并且其中在温育步骤结束后，从所述第一室中去除未与待测定的细菌相结合的标记试剂，并引导其通过所述膜而进入到所述第二室中。6.根据权利要求1至5之一的方法，其特征在于，使用具有大约0.5-3μm的孔径的膜。7.根据权利要求1至6之一的方法，其特征在于，在根据步骤(a)的温育之前和/或期间，进行所述标...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·艾博特，M·瑞驰，W·卢比特兹，
申请(专利权)人：瑞士菌分析股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH