液滴划分的基于PCR的文库制备制造技术

提供了制备靶基因富集的文库的方法。在一个方面，该方法包括将多核苷酸片段划分成多个分区，其中各分区还包含多个用于扩增靶基因的引物对，并且其中引物包含衔接子序列的部分；扩增靶基因序列以生成包含在任一末端侧接衔接子序列的部分的靶基因序列；纯化扩增子；并且使用包含全长衔接子序列的引物扩增该扩增子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】液滴划分的基于PCR的文库制备相关申请的交叉引用本申请要求2015年12月30日提交的美国临时申请号62/272,874的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。以ASCII文本文件提交的“序列表”、表格、或计算机程序表附页的引用将2016年12月28日于机器型号IBM-PC，MS-Windows操作系统创建的31341字节的文件094868-111210PC-1032580_SequenceListing.txt中所记载的序列表全文纳入本文用于所有目的。
技术介绍
靶向测序可用于研究基因组样品中选定的基因，基因区域或基因组元素，从而提高下一代测序的效率。为了在测序之前富集靶区域，使用了几种方法，包括使用靶探针从测序文库中进行杂交捕获以及通过使用靶特异性引物对样品DNA进行PCR扩增来产生测序文库。通过PCR扩增产生文库固有地引入了显著的扩增偏好，这导致序列易变的覆盖并显著影响定量准确性。
技术实现思路
一方面，提供了制备靶基因富集的文库的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(a)提供多个多核苷酸片段；(b)将所述多核苷酸片段划分成多个分区，其中每个分区还包含多个引物对，每个引物对包含用于扩增靶基因的正向引物和反向引物，其中所述正向引物包含(i)包含第一衔接子序列的部分的多核苷酸序列和(ii)靶基因特异性正向引物序列，并且其中所述反向引物包含(i)包含第二衔接子序列的部分的多核苷酸序列和(ii)靶基因特异性反向引物序列；(c)用分区中的引物对之一扩增该分区中的多核苷酸片段的靶基因序列，由此产生扩增子，所述扩增子包含靶基因序列，所述靶基因序列在5′末端侧接第一衔接子序列的部分并在3′末端侧接第二衔接子序列的部分；(d)纯化扩增子；并且(e)使用包含第一衔接子序列的至少部分的第一扩增子引物和包含第二衔接子序列的至少部分的第二扩增子引物扩增所述扩增子。在一些实施方式中，多核苷酸片段是基因组DNA片段。在一些实施方式中，多核苷酸片段的长度为至少约100个核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸片段的长度为至多约2000个，至多约5000个，至多约10000个，至多约25000个，或至多约50000个核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸片段的长度为约100至约2000个核苷酸。在一些实施方式中，在划分步骤(b)中，每个分区包含至少20个引物对。在一些实施方式中，每个分区包含至少50个引物对。在一些实施方式中，每个分区包含至少200个引物对。在一些实施方式中，每个分区包含至少500个引物对。在一些实施方式中，用于扩增的靶基因或基因区是具有稀有突变的基因或基因区。在一些实施方式中，用于扩增的靶基因或基因区是与癌症或遗传疾病相关的基因或基因区。在一些实施方式中，第一衔接子序列是P7衔接子序列，第二衔接子序列是P5衔接子序列。在一些实施方式中，第一衔接子序列是P5衔接子序列，第二衔接子序列是P7衔接子序列。在一些实施方式中，P7衔接子序列是与SEQIDNO：4具有至少70％相同性(例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的相同性)的序列。在一些实施方式中，P7衔接子序列是SEQIDNO：4。在一些实施方式中，P5衔接子序列是与SEQIDNO：1具有至少70％相同性(例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的相同性)的序列。在一些实施方式中，P5衔接子序列是SEQIDNO：1。在一些实施方式中，对于包含第一衔接子序列的部分的正向引物或反向引物，第一衔接子序列的该部分包含第一衔接子序列的至少20个连续核苷酸。在一些实施方式中，第一衔接子序列的该部分与SEQIDNO：7或SEQIDNO：8具有至少70％相同性(例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的相同性)。在一些实施方式中，第一衔接子序列的该部分具有SEQIDNO：7或SEQIDNO：8的序列。在一些实施方式中，第一衔接子序列和/或第二衔接子序列包含条形码序列。在一些实施方式中，包含条形码序列的第一衔接子序列和/或第二衔接子序列与SEQIDNO：3或SEQIDNO：6具有至少70％相同性(例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的相同性)。在一些实施方式中，用于扩增靶基因的正向引物与SEQIDNO：9-58中的任一个(例如，SEQIDNO：9，SEQIDNO：10，SEQIDNO：11，SEQIDNO：12，SEQIDNO：13，SEQIDNO：14，SEQIDNO：15，SEQIDNO：16，SEQIDNO：17，SEQIDNO：18，SEQIDNO：19，SEQIDNO：20，SEQIDNO：21，SEQIDNO：22，SEQIDNO：23，SEQIDNO：24，SEQIDNO：25，SEQIDNO：26，SEQIDNO：27，SEQIDNO：28，SEQIDNO：29，SEQIDNO：30，SEQIDNO：31，SEQIDNO：32，SEQIDNO：33，SEQIDNO：34，SEQIDNO：35，SEQIDNO：36，SEQIDNO：37，SEQIDNO：38，SEQIDNO：39，SEQIDNO：40，SEQIDNO：41，SEQIDNO：42，SEQIDNO：43，SEQIDNO：44，SEQIDNO：45，SEQIDNO：46，SEQIDNO：47，SEQIDNO：48，SEQIDNO：49，SEQIDNO：50，SEQIDNO：51，SEQIDNO：52，SEQIDNO：53，SEQIDNO：54，SEQIDNO：55，SEQIDNO：56，SEQIDNO：57或SEQIDNO：58)具有至少70％的相同性(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同性)。在一些实施方式中，用于扩增靶基因的正向引物包含SEQIDNO：9-58中的任一个。在一些实施方式中，用于扩增靶基因的反向引物与SEQIDNO：59-108中的任一个(例如，SEQIDNO：59，SEQIDNO：60，SEQIDNO：61，SEQIDNO：62，SEQIDNO：63，SEQIDNO：64，SEQIDNO：65，SEQIDNO：66，SEQIDNO：67，SEQIDNO：68，SEQIDNO：69，SEQIDNO：70，SEQIDNO：71，SEQIDNO：72，SEQIDNO：73，SEQIDNO：74，SEQIDNO：75，SEQIDNO：76，SEQIDNO：77，SEQIDNO：78，SEQIDNO：79，SEQIDNO：80，SEQIDNO：81，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备靶基因富集的文库的方法，所述方法包括：(a)提供多个多核苷酸片段；(b)将所述多核苷酸片段划分成多个分区，其中每个分区还包含多个引物对，每个引物对包含用于扩增靶基因的正向引物和反向引物，其中所述正向引物包含(i)包含第一衔接子序列的部分的多核苷酸序列和(ii)靶基因特异性正向引物序列，并且其中所述反向引物包含(i)包含第二衔接子序列的部分的多核苷酸序列和(ii)靶基因特异性反向引物序列；(c)用分区中的引物对之一扩增该分区中的多核苷酸片段的靶基因序列，由此产生扩增子，所述扩增子包含靶基因序列，所述靶基因序列在5′末端侧接第一衔接子序列的部分并在3′末端侧接第二衔接子序列的部分；(d)纯化所述扩增子；并且(e)使用包含第一衔接子序列的至少部分的第一扩增子引物和包含第二衔接子序列的至少部分的第二扩增子引物扩增所述扩增子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.30 US 62/272,8741.一种制备靶基因富集的文库的方法，所述方法包括：(a)提供多个多核苷酸片段；(b)将所述多核苷酸片段划分成多个分区，其中每个分区还包含多个引物对，每个引物对包含用于扩增靶基因的正向引物和反向引物，其中所述正向引物包含(i)包含第一衔接子序列的部分的多核苷酸序列和(ii)靶基因特异性正向引物序列，并且其中所述反向引物包含(i)包含第二衔接子序列的部分的多核苷酸序列和(ii)靶基因特异性反向引物序列；(c)用分区中的引物对之一扩增该分区中的多核苷酸片段的靶基因序列，由此产生扩增子，所述扩增子包含靶基因序列，所述靶基因序列在5′末端侧接第一衔接子序列的部分并在3′末端侧接第二衔接子序列的部分；(d)纯化所述扩增子；并且(e)使用包含第一衔接子序列的至少部分的第一扩增子引物和包含第二衔接子序列的至少部分的第二扩增子引物扩增所述扩增子。2.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸片段是基因组DNA片段。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多核苷酸片段的长度是至少约100个核苷酸。4.如权利要求3所述的方法，其中所述多核苷酸片段的长度是约100至约2000个核苷酸。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在划分步骤(b)中，各分区包含至少50个引物对。6.如权利要求5所述的方法，其中在划分步骤(b)中，各分区包含至少200个引物对。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中用于扩增的靶基因是具有稀有突变的基因。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中(i)第一衔接子序列是P7衔接子序列并且第二衔接子序列是P5衔接子序列；或(ii)第一衔接子序列是P5衔接子序列并且第二衔接子序列是P7衔接子序列。9.如权利要求8所述的方法，其中所述第一衔接子序列是与SEQIDNO：4有至少70％相同性的P7衔接子序列。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中包含第一衔接子序列的部分的正向引物包含第一衔接子序列的至少20个连续核苷酸。11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一衔接子序列的部分与SEQIDNO：8有至少70％相同性。12.如权利要求8所述的方法，其中所述第二衔接子序列是与SEQIDNO：1有至少70％相同性的P5衔接子序列。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中包含第二衔接子序列的部分的反向引物包含第二衔接子序列的至少20个连续核苷酸。14.如权利要求13所述的方法，其中所述第二衔接子序列的部分与SEQIDNO：7有至少70％相同性。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第一衔接子序列和/或第二衔接子序列包含条形码序列。16.如权利要求15所述的方法，其中在步骤(e)中，第一引物与SEQIDNO：6有至少70％相同性。17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述分区是液滴。18.如权利要求1-17中任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·霍奇斯，N·埃雷迪亚，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US