一种高细胞毒性的CIK细胞制剂及其培养方法技术

本发明专利技术提供了一种高细胞毒性的CIK细胞制剂及其培养方法，涉及肿瘤治疗领域。该培养方法，其包括：将抗凝外周血离心，移除血浆层后与淋巴细胞分离液混合，分离出外周血单个核细胞；用淋巴细胞培养基调整外周血单个核细胞的细胞浓度，并加入IL‑2、IFN‑γ和自体血浆，置于培养瓶中进行培养；体外扩增培养，离心收集得到的CIK细胞。通过这种培养方法，可缩短细胞培养时间，且得到的CIK细胞制剂中细胞活性大于95％，回输后可以增强患者自身的免疫力，增大抗肿瘤效应。

A highly cytotoxic CIK cell preparation and its culture method

The invention provides a highly cytotoxic CIK cell preparation and a culture method thereof, and relates to the field of tumor treatment. The culture method includes: centrifuging the anticoagulant peripheral blood, removing the plasma layer and mixing it with the lymphocyte separation liquid to isolate the peripheral blood mononuclear cells; adjusting the cell concentration of the peripheral blood mononuclear cells with the lymphocyte culture medium, and adding IL_2, IFN_gamma and autologous plasma to culture in vitro; CIK cells were obtained by centrifugation. By this method, the time of cell culture can be shortened, and the activity of CIK cells is more than 95%. After reinfusion, the immunity of patients can be enhanced and the anti-tumor effect can be enhanced.

【技术实现步骤摘要】
一种高细胞毒性的CIK细胞制剂及其培养方法
本专利技术涉及肿瘤治疗领域，具体而言，涉及一种高细胞毒性的CIK细胞制剂及其培养方法。
技术介绍
癌症作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害着人类健康，已成为人类的第一杀手。生物免疫治疗是目前一种新兴的治疗手段，它主要是通过体外扩增培养免疫细胞，再回输到体内，可增强患者的免疫力。这种生物免疫治疗的杀癌力强、杀癌谱广、杀除残余的癌细胞，其对正常细胞无损伤，且能恢复手术造成的损伤、提高化疗的敏感性，减轻副作用，恢复体力，缓解症状，延长癌症患者的生存期。近些年来，过继免疫细胞治疗，如细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkiller，CIK)、TIL(tumorinfiltratinglymphocyte，TIL)、CART、CTL等在多种恶性实体瘤如肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌等的治疗中，获得了显著的临床效果。CIK是一类异质性细胞，其可同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞。在正常人的外周血中少见，仅占1～5％，其既具有T淋巴细胞抵抗肿瘤细胞，又具有NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性。然而，由于肿瘤病人的免疫功能受损，免疫细胞功能减弱，采用现有技术制备的CIK细胞杀伤肿瘤能力低下，影响CIK疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高细胞毒性的CIK细胞制剂及其培养方法，通过这种培养方法，可缩短细胞培养时间，且得到的CIK细胞制剂中细胞活性大于95％，回输后可以增强患者自身的免疫力，增大抗肿瘤效应。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种高细胞毒性的CIK细胞的培养方法，其包括：将抗凝外周血离心，移除血浆层后与淋巴细胞分离液混合，分离出外周血单个核细胞；用淋巴细胞培养基调整外周血单个核细胞的细胞浓度，并加入IL-2、IFN-γ和自体血浆，置于培养瓶中进行培养；体外扩增培养，离心收集得到的CIK细胞。一种由上述培养方法制得的CIK细胞制剂。与现有技术相比，本专利技术的有益效果例如包括：本专利技术提供的这种CIK细胞的培养方法，通过将从人体外周血中分离出单个核细胞，并使其在体外与细胞因子IL-2和IFN-γ共同孵育培养一段时间后获得的一群异质性细胞。这些异质性细胞经过体外扩增培养后，具有较高杀伤活性的细胞数量明显增多(培养至12天时，CIK细胞的数量为13.07±1.37)×109个，且细胞活性率>95％)，回输到肿瘤患者体内后能够有效增强其自身的免疫力，增大抗肿瘤效应，改善肿瘤患者的生活质量。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本专利技术实验例中两组患者治疗前后的Karnofsky评分的比较，其中，**P<0.01vsCIK治疗前。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本实施方式提供一种高细胞毒性的CIK细胞的培养方法，其包括以下步骤：步骤S1:将抗凝外周血离心，移除血浆层后与淋巴细胞分离液混合，分离出外周血单个核细胞。其中，抗凝外周血可以为肝素抗凝血，不包括EDTA抗凝血。将抗凝外周血离心后，上层为血浆层，下层血沉棕黄层(Buffycoat)+红细胞层。其中，血浆层用于制备自体血浆，血沉棕黄层(Buffycoat)+红细胞层用于制备外周血单个核细胞。进一步地，自体血浆的制备方法包括：将血浆层于50～60℃下放置25～35min后，再于0～10℃下静置10～20min后，离心取上清。较为优选地为，将血浆层于54～58℃下放置28～32min后，再于2～6℃下静置18～22min后，离心取上清，即得。步骤S2:用淋巴细胞培养基调整外周血单个核细胞的细胞浓度，并加入IL-2、IFN-γ和自体血浆，置于培养瓶中进行培养。进一步地，外周血单个核细胞的细胞浓度为0.5×105～0.5×107个/mL。进一步地，培养瓶中，IL-2的终浓度为800～1200IU/mL，IFN-γ的终浓度为800～1200IU/mL。进一步地，培养瓶中，自体血浆的终浓度为0.5～1.5％。较为优选地，培养体系包括：用淋巴细胞培养基调整外周血单个核细胞的细胞浓度为0.5×105～0.5×107个/mL(共30mL)，并加入60μL的IFN-γ(终浓度为800～1200IU/mL)、60μL的IL-2(终浓度为800～1200IU/mL)，600μL的自体血浆(终浓度为1％)。进一步地，淋巴细胞培养基为GT-T551H3培养基。进一步地，培养瓶的培养条件为35～40℃、CO2培养箱。步骤S3:体外扩增培养，离心收集得到的CIK细胞。本实施方式还提供一种由上述培养方法制得的CIK细胞制剂。进一步地，该CIK细胞制剂还包括人血清白蛋白、生理盐水。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述：实施例1本实施例提供一种高细胞毒性的CIK细胞制剂，其培养方法包括：(1).采血：经传递窗接过外周血100mL(不可EDTA抗凝)，酒精喷后拿进安全柜，将采集的外周血混匀后加入50mL的无菌离心管中，室温，700g下离心沉降20min，上层A为血浆层(约占50％)，下层B为Buffycoat+红细胞层。(2).自体血浆制备：将血浆层置于50ml新管中，于56℃下放置30min，并于4℃下静置15min；随后，在800g、4℃离心25min，取出上清液置于50mL的离心管中作为自体血浆备用。(3).外周血单个核细胞分离：a.将下层B(即Buffycoat+红细胞层)与D-PBS混合均匀，总体积为50mL，得到稀释液；b.吸取25mL的a步骤中的稀释液，贴管壁加入12.5mL的淋巴细胞分离液中，于室温、2000rpm下离心20min；c.离心结束后，加入D-PBS10mL于50ml离心管中，小心吸取白膜层至50mL离心管中，PBS补齐体积至3倍以上，室温下2000rpm离心10分钟。d.离心结束后，弃上清，震荡使细胞重悬，加入10mLPBS充分混匀后再加PBS至40mL，混匀后于室温下1000rpm离心10分钟。e.离心结束后，弃上清，震荡使细胞重悬，加入20mlGT-T551H3培养基混匀，再加入GT-T551H3至40ml混匀，吸取50μL细胞悬液于1.5mlEP管中，细胞计数。f.室温下，1000rpm离心10分钟，弃上清后重悬细胞，加入30mlGT-T551H3充分混匀后，吸入包被瓶底。加入30mLGT-T551H3培养基至细胞终浓度约0.5×106/ml，再加入60μLIL-2(终浓度1000IU/Ml)、60μLIFN-γ(终浓度1000IU/Ml)、600μL自体血浆(终浓度1％)，混匀后吸入培养瓶中，口部酒精消毒后置于37℃CO2培养箱中扩增培养，自体血浆标记封口。(4)体外扩增培养，离心收集得到的CIK细胞。实施例2本实施例提供一种高细胞毒性的CIK细胞制剂，其培养方法与实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高细胞毒性的CIK细胞的培养方法，其特征在于，其包括：将抗凝外周血离心，移除血浆层后与淋巴细胞分离液混合，分离出外周血单个核细胞；用淋巴细胞培养基调整所述外周血单个核细胞的细胞浓度，并加入IL‑2、IFN‑γ和自体血浆，置于培养瓶中进行培养；以及体外扩增培养，离心收集得到的CIK细胞。

【技术特征摘要】
1.一种高细胞毒性的CIK细胞的培养方法，其特征在于，其包括：将抗凝外周血离心，移除血浆层后与淋巴细胞分离液混合，分离出外周血单个核细胞；用淋巴细胞培养基调整所述外周血单个核细胞的细胞浓度，并加入IL-2、IFN-γ和自体血浆，置于培养瓶中进行培养；以及体外扩增培养，离心收集得到的CIK细胞。2.根据权利要求1所述的高细胞毒性的CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述培养瓶中，所述IL-2的终浓度为800～1200IU/mL，所述IFN-γ的终浓度为800～1200IU/mL。3.根据权利要求1所述的高细胞毒性的CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述淋巴细胞培养基为GT-T551H3培养基。4.根据权利要求1所述的高细胞毒性的CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述自体血浆的制备方法包括：将所述血浆层于50...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立平，王炜玮，曲迅，李家敏，王方聚，张明徽，刘君，周武松，田明一，吕春明，隋丽，战美娜，韩佳佳，宁应梅，
申请(专利权)人：龙口南山养生谷肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：山东,37