一种新型苯乙烯环氧化酶及其功能制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于海洋微生物Marinobacterium litorale DSM 23545的新型苯乙烯环氧化酶基因及其在催化不对称环氧化中的应用。该酶可以催化共轭和非共轭的苯乙烯类衍生物生成对应的环氧化物，尤其对共轭的苯乙烯、肉桂醇和4‑乙烯基‑2，3‑二氢苯并呋喃具有较高的催化活性。

A new type of styrene cyclooxygenase and its function

The present invention discloses a novel styrene cyclooxygenase gene derived from marine microorganism Marinobacterium litorale DSM 23545 and its application in catalytic asymmetric epoxidation. The enzyme can catalyze the formation of the corresponding epoxides by the conjugated and non conjugated styrene derivatives, especially for the conjugated styrene, cinnamol, and 4 Vinyl vinyl alcohol 2, 3, two hydrogen benzofuran.

【技术实现步骤摘要】
一种新型苯乙烯环氧化酶及其功能
本专利技术涉及一种新型苯乙烯环氧化酶MlSMO基因及其催化功能，该环氧化酶来源于一株海洋微生物MarinobacteriumlitoraleDSM23545，可利用其对共轭和非共轭苯乙烯类衍生物进行环氧化生物催化反应，属于应用微生物及酶工程领域。
技术介绍
手性环氧化合物是有机合成、制药工业、香料工业的重要中间体，具有广泛的应用。传统环氧化合物的生产采用化学催化法。通常化学催化法存在许多不足，其反应条件苛刻，选择性低，副产物多，分离纯化困难，还会造成环境污染。随着生物催化技术的发展，以环氧化酶生物催化获得环氧化合物成为关注的热点。近二十多年来，有许多关于环氧化酶的筛选和生物转化的文献报道。目前报道的苯乙烯环氧化酶主要来自假单胞菌属，也包括极少的红球菌属和宏基因组等。其中催化苯乙烯生成环氧化物的环氧化酶的基因为styA和styB，分别编码苯乙烯单加氧酶(SMO)和还原酶(Reductase)。这些菌株中，特别是来源于假单胞菌属的苯乙烯环氧化酶基因之间具有极高的相似性，催化活性也不是很理想。因此，筛选新的高活性苯乙烯环氧化酶基因，进一步发展其在不对称环氧化催化中的应用，具有重要意义。我们知道海洋微生物在生态系统中发挥着许多重要的作用，同时是许多生物活性物质和一些重要蛋白的来源菌株。但是到目前为止，未见有来源于海洋微生物的苯乙烯环氧化酶报道。另一方面，随着测序技术的不断发展，为研究者提供了大量的基因组数据信息，通过基因组数据库挖掘的方法是高效寻找新型酶源的有效途径。
技术实现思路
本专利技术目的是公开一种来源于海洋微生物MarinobacteriumlitoraleDSM23545的苯乙烯环氧化酶MlSMO的基因，并提供了该基因构建的重组菌用于催化不对称环氧化反应的方法。本专利技术中，术语“苯乙烯环氧化酶”、“SMO”、“苯乙烯单加氧酶”可以互换使用。本专利技术的环氧化酶MlSMO，其基因序列包括styA、styB以及两者之间的连接序列。其中，styA(1248bp，见SEQIDNo.1)和styB(516bp，见SEQIDNo.3)，分别编码苯乙烯单加氧酶(SMO，见SEQIDNo.4)和还原酶(Reductase，见序列SEQIDNo.5)；连接styA与styB之间的碱基长度为60bp(见SEQIDNo.2)。本专利技术的环氧化酶MlSMO的新颖性：本专利技术涉及的蛋白StyA和StyB与NCBI数据库中已报道序列的相似性见下表，从表中可以看出环氧化酶MlSMO在蛋白质水平上的相似度<70％，具有新颖性。本专利技术的环氧化酶MlSMO是这样获得的：环氧化酶MlSMO的获得是通过基因组数据库挖掘的方法获得的。首先我们以已报道的来源于Pseudomonasp.LQ26的StyA蛋白序列为参考序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索，得到数量较为庞大的序列，排除已经研究过的序列，同时根据酶来源菌株及序列相似度，最终我们筛选到了该序列(该蛋白的NCBI登录号为：WP_027855270(StyA)和WP_051299263(StyB))，并根据蛋白序列进行了核苷酸密码子偏好性的优化，优化后的序列见SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。而后将该酶的基因由上海生工生物工程有限公司直接合成，并连接至pET28a(+)载体，上游限制性内切酶位点为BamHI，下游限制性内切酶位点为SacⅠ，获得的质粒命名为pET28-MlSMO。接着将质粒pET28-MlSMO转入大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组表达菌E.coli(pET28-MlSMO)。根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，MlSMO表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。苯乙烯环氧化酶的表达：挑取重组子E.coli(pET28-MlSMO)单菌落，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中于37℃、180rpm培养12h作为种子培养基，以1％接种量接种于TB培养基中，37℃振荡培养3h，而后降温至20℃诱导styAB基因表达，诱导18～21h后，4℃冷冻离心，收获菌体。该菌体作为生物催化剂用于后续生物催化反应。重组质粒pET28-MlSMO表达StyA、StyB蛋白电泳图见附图1。本专利技术还提供了MlSMO全细胞催化体系及该体系在针对不同底物的生物转化中的应用。全细胞催化是将上述获得的重组菌E.coli(pET28-MlSMO)的湿菌体(静息细胞)作为生物催化剂，进行生物催化反应。生物催化反应体系：反应体系为5mL，包括0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.5～8.0)，1g湿菌体，1～10mM底物。对于疏水性底物，如苯乙烯，在全细胞催化体系中加入10％(V/V)环己烷。本专利技术与已有技术相比具有如下优势：本专利技术涉及的苯乙烯环氧化酶MlSMO与之前报道的来源于假单胞菌属的环氧化酶(PsSMO，NCBI登录号GU593979.1))相比，具有较高的活力，尤其是对苯乙烯、肉桂醇和4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃，ee值均大于99％。其中催化4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃生成的(S)-2,3-二氢-4-环氧丙基苯并呋喃是合成褪黑激素受体作用剂的重要中间体，目前该化合物主要是通过环氧水解酶的动力学拆分得到。在该拆分过程中其收率45％，这也就意味着55％的底物不能被利用，虽然可以通过二醇的消旋过程提高底物的利用率，但是也增加了反应过程增加生产成本，因此利用苯乙烯环氧化酶MlSMO全细胞催化制备该化合物具有明显的优势。附图说明附图1重组质粒pET28-MlSMO表达StyA、StyB蛋白电泳图。具体实施方式以下结合实施例详细地说明本专利技术。实施方案为便于更好的理解本专利技术，但并非对本专利技术的限制。实施例1MlSMO异源表达将质粒pET28-MlSMO转入大肠杆菌BL21感受态后，提取单克隆接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基于37℃、180rpm培养12h作为种子液，以1％接种率转接至新鲜TB培养基中(500mL容量摇瓶装液200mL培养基)，于37℃振荡培养3h，随后于20℃诱导18h后，以4000rpm、4℃冷冻离心10min收获菌体，再用0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.5)重悬洗涤两次，得到湿菌体。该湿菌体用作生物催化剂用于后续生物催化。另外，可将湿菌体重悬于上述相同缓冲液中，以超声波破碎机破碎菌体后，SDS-PAGE查看MlSMO的表达情况。实施例2苯乙烯环氧化酶全细胞生物催化条件优化最适反应温度优化：取实施例1中新鲜培养的湿菌体1g，重悬于5mL磷酸钾缓冲液(0.1M、pH6.5)，加入10％环己烷和5mg苯乙烯。分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，200rpm震荡反应4h。反应完成后，等体积乙酸乙酯终止反应并萃取，加入适量无水硫酸钠干燥，旋蒸去除溶剂，以GC和HPLC检测分析。结果如表-2所示，30℃时环氧产率最高。表-2MlSMO最适反应温度优化最适反应pH值优化：取实施例1中新鲜培养的湿菌体1g，分别重悬于5mL不同pH的0.1M磷酸钾缓冲液为(5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苯乙烯环氧化酶基因，其特征是：包含styA、styB以及两者之间的连接序列，其中styA的核苷酸长度为1248bp，序列为SEQ ID No.1所示，编码的苯乙烯单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；连接序列长度为60bp，序列为SEQ ID No.2所示；styB的核苷酸长度为516bp，序列为SEQ ID No.3所示，编码的还原酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种苯乙烯环氧化酶基因，其特征是：包含styA、styB以及两者之间的连接序列，其中styA的核苷酸长度为1248bp，序列为SEQIDNo.1所示，编码的苯乙烯单加氧酶的氨基酸序列为SEQIDNo.4所示；连接序列长度为60bp，序...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴中柳，蒲伟，崔璨，郭超，刘艳，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51