将原始生殖细胞分化为功能上成熟的卵母细胞的培养方法技术

本发明专利技术的课题是提供一种通过体外培养将原始生殖细胞分化为功能GV期卵母细胞的方法。本发明专利技术涉及一种通过体外培养将原始生殖细胞分化为功能GV期卵母细胞的方法，其包括：(a)通过在消除雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤；(b)部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤，其中卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层构成产生的次级卵泡；和(c)通过在含有高分子化合物的培养基中培养构成次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层，使卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞的步骤。

Differentiation of primordial germ cells into functionally mature oocytes

The subject of the invention is to provide a method for differentiating primordial germ cells into functional GV oocytes by in vitro culture. The present invention relates to a method of differentiation of primordial germ cells into functional GV oocytes by culture in vitro, which includes: (a) producing secondary follicles by cultivating primordial germ cells and supporting cells adjacent to the primitive germ cells by eliminating the effects of estrogen or factors that have the same function as estrogen. The steps of (b) partially cutting the binding between the granular cell layer and the membrane cell layer, in which the oocyte, granular cell layer and membrane cell layer form secondary follicles; and (c) fostering the oocyte, granular cell layer and membrane cell layer that constitute the secondary follicle in the medium containing polymer compounds. The process of differentiating oocytes into functional GV oocytes.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】将原始生殖细胞分化为功能上成熟的卵母细胞的培养方法
本专利技术涉及用于将原始生殖细胞分化成功能上成熟的卵母细胞的培养方法。
技术介绍
只有生殖细胞能够将遗传信息传递给下一代。而且，生殖细胞中的卵子起着启动发育并引导早期发育的作用，因此，卵子负责了非常重要的主要作用。体细胞分裂阶段的大量原始生殖细胞存在于雌性哺乳动物的胚胎性腺中。出生前，他们都转向减数分裂并分化成卵母细胞。转移到减数分裂后，卵母细胞不能再次增殖，并且卵巢中的卵母细胞处于停滞的发育阶段。根据动物物种独特的发情周期和排卵次数，只有一部分卵母细胞可以生长并成熟。因此，雌性在其一生中产生的可育卵子的数量与原始生殖细胞的数量及作为雄性生殖细胞的精子相比非常小(参见非专利文献1和2)。此外，分化成功能卵子的详细机制尚未阐明。鉴于上述情况，建立将原始生殖细胞分化成卵子的体外培养方法可以成为克服卵子发生过程中的上述问题的一种方法。此外，这种体外培养体系的建立确保了卵子的新来源。然而，目前还没有关于减数分裂前的雌性原始生殖细胞和卵泡生成前的未成熟的卵母细胞能够通过体外培养成功分化成功能卵子(即能够产生后代的卵子)的报道。这是由于在培养条件下还没有重现用于足够支持卵子分化的卵泡的形成及卵母细胞的生成和成熟。已经提出了一些用于从原始生殖细胞产生全功能卵子的体外培养体系，但是即使通过这些方法，由于卵泡形成异常和卵母细胞生长不足，因此尚未达到下一代发育。例如，非专利文献3公开了一种通过在激活素A的存在下培养胎龄12.5天(12.5dayspostcoitum(dpc))的雌性小鼠性腺的一部分，然后与颗粒膜细胞(preantralgranulosacells：PAGC)共培养，提高分化成第二次减数分裂中期卵子的效率的方法。但是，没有关于通过非专利文献3的方法获得的卵子可以发育到下一代的报道。在小鼠中，还有报道称，将12.5-dpc胚胎性腺移植到成年雌性小鼠中，并且在移植后14天取得的次级卵泡通过体外培养分化成能够产生后代的功能卵子(参见非专利文献4)。最近，通过体外培养从ES细胞和iPS细胞产生原始生殖细胞样细胞。也如所报道的，将这些细胞与12.5-dpc的性腺体细胞共培养后，将该细胞凝结块移植到小鼠体内，以分化成能够产生后代的功能卵母细胞(参见非专利文献5)。然而，在非专利文献4和5中，需要将靶细胞移植到小鼠体内以实现减数分裂和卵泡形成并获得成熟的卵母细胞。这意味着，将小鼠个体用于卵母细胞生长，并且卵母细胞没有通过体外培养完全成熟。非专利文献1公开了一种卵母细胞培养方法，其包括在高分子化合物存在下培养卵母细胞和其外周体细胞的复合体的步骤。非专利文献1中的方法能够有效地使从成体卵巢分离的卵母细胞在体外成熟。然而，非专利文献1的方法是：通过从活体内的发育中的卵泡收集卵母细胞-颗粒细胞复合体，获得在第一次减数分裂中的前期停滞的卵母细胞；使该卵母细胞进行体外生长和体外成熟。该方法不是用原始生殖细胞开始体外培养的方法。因此，目前还没有关于使原始生殖细胞或原始生殖细胞样细胞通过体外培养而成功形成功能卵子而不使用活体的方法的报道。如果能够使哺乳动物原始生殖细胞在减数分裂前通过体外培养发育为功能卵子，则能够确保大量的卵子。该方法对于将复杂的卵子形成机制可视化和理解该机制也是有帮助的。因此，通过体外培养从原始生殖细胞产生功能卵子的方法是所期望的。[现有技术][专利文献]专利文献1：日本未审查专利申请公开No.2004-173635[非专利文献]非专利文献1：Tam,P.P.&Snow,M.H.“Proliferationandmigrationofprimordialgermcellsduringcompensatorygrowthinmouseembryos.”JEmbryolExpMorphol64,133-147(1981)非专利文献2：Miyano，T.JSAR杰出研究奖。“Invitrogrowthofmammalianoocytes.”JReprodDev51,169-176(2005)非专利文献3：Zhang,Z.P.等人,“GrowthofMouseOocytestoMaturityfromPremeioticGermCellsInvitro”PLoSOne7，e41771(2012)非专利文献4：ShenW，ZhangD，QingT，ChengJ，BaiZ，ShiY，DingM，DengH.，“Liveoffspringproducedbymouseoocytesderivedfrompremeioticfetalgermcells.”BiolReprod75，615-623(2006)非专利文献5：HayashiK.等人，“OffspringfromOocytesDerivedfrominvitroPrimordialGermCell-likeCellsinMice.”Science338,971-975(2012)
技术实现思路
[本专利技术解决的问题]本专利技术的问题在于提供一种将原始生殖细胞分化为功能卵母细胞的方法。而且，本专利技术的问题在于提供一种从通过分化方法获得的卵母细胞获得功能卵子的方法。[解决问题的手段]为了解决上述问题，本专利技术的专利技术人研究了卵巢培养方法以增强起始事件如减数分裂、卵泡形成和卵泡生长。首先，通过气-液界面方法(Trowell,O.A.“Thecultureofmatureorgansinasyntheticmedium.”ExpCellRes16,118-147(1959))，在含有10％FBS的α-MEM培养基中在-COL上培养12.5dpc胚胎性腺(图1a)17天，作为已知的标准培养条件。在12.5dpc胚胎性腺中，将作为减数分裂期的标记的SCP3进行免疫染色，未检测到SCP3阳性细胞。然而，在培养的第5天，无论是否与中肾共培养，都检测到许多SCP3阳性细胞。这意味着卵母细胞即使在体外培养中也能开始减数分裂。对于在卵巢中次级卵泡形成后期的持续的卵母细胞生长，需要复杂的血管化组织和血流量。然而，由于培养卵巢不具有这样的组织和血流量，因此有必要分离次级卵泡并重新培养。另一方面，在培养的第17天，尝试从卵巢分离次级卵泡时，在一个卵巢中存在超过100个正在生长的卵母细胞。然而，在已知培养条件下的卵巢培养的情况下，很难分离卵泡。正常卵泡形成球形结构并生长，其中该球形结构为卵母细胞表面被颗粒细胞层包围，颗粒细胞层的表面进一步被膜细胞层包围。另一方面，在培养的卵巢中，这样的球形卵泡的数量很少，卵泡是脆弱的，并且当这些卵泡被分离时，大量卵母细胞被剥去。在通过体外培养获得的卵巢中，对形成卵泡并赋予其强度的基膜结构蛋白的层粘连蛋白进行免疫组织化学分析。结果表明，在来自出生后10天的小鼠的卵巢中，将卵巢组织在平面上切割并观察时，基膜(层粘连蛋白)以呈圆形地包围一个卵泡的方式局部存在，而在体外培养的卵巢中，观察到层粘连蛋白不呈圆形而在同一平面上断断续续地存在。另外，位于其表面且原本应该以卵泡的形式分别独立的膜细胞群的一部分与上下左右相邻的卵泡共同存在，层粘连蛋白也显示出花形的局部存在等，这样的膜细胞层的形成异常非常显著(参照图5a)。因此，需要一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能GV期卵母细胞的方法，包括：(a)通过在消除雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近所述原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤；(b)部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤，其中卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层构成所产生的次级卵泡；和(c)通过在含有高分子化合物的培养基中培养构成所述次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层，使卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.17 JP 2015-1845131.通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能GV期卵母细胞的方法，包括：(a)通过在消除雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近所述原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤；(b)部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤，其中卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层构成所产生的次级卵泡；和(c)通过在含有高分子化合物的培养基中培养构成所述次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层，使卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中在消除雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子的影响的条件下的培养包括在雌激素抑制剂的存在下培养或使用无血清培养基培养。3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：尾畑弥生，平尾雄二，林克彦，
申请(专利权)人：学校法人东京农业大学，国立研究开发法人农业·食品产业技术综合研究机构，国立大学法人九州大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP