解析和定量无细胞RNA的方法技术

本发明专利技术大体上涉及通过表征生物样品中的循环核酸来评估组织的健康状况的方法。根据某些实施例，评估组织的健康状况的方法包括以下步骤：检测生物样品中的RNA的样品含量，比较RNA的样品含量与对所述组织具有特异性的RNA的参考含量，确定在所述样品含量与所述参考含量之间是否存在差值，且如果检测到差值则将所述组织表征为异常。

Analytical and quantitative method of cell free RNA

The invention generally relates to a method for assessing the health status of an organization by characterizing circulating nucleic acids in biological samples. According to some embodiments, the methods of assessing the health status of the tissue include the following steps: detecting the sample content of the RNA in the biological sample, comparing the sample content of the RNA and the reference content of the specific RNA, determining whether there is a difference between the content of the sample and the reference content described, and if the test is detected. To the difference, the organization is characterized by an anomaly.

【技术实现步骤摘要】
解析和定量无细胞RNA的方法相关申请案本申请案主张在2012年1月27日申请的美国临时专利申请案序号61/591,642的权益和优先权，所述美国临时专利申请案的全部内容以引用的方式并入在此。
本专利技术涉及含基因材料的生物样品中的核酸分析的领域。具体来说，本专利技术的方法涉及定量生物样品中的组织特异性核酸。
技术介绍
判断个体体内器官的健康状况常常具有挑战性。医生常常被强制使用昂贵成像技术或进行针对癌症筛查的侵入性活检以识别诊断性生物标记物且监测肿瘤起始和进展。活检的侵入性性质使其不适于患者的普遍筛查。另外，许多诊断性生物标记物仅在癌细胞系中或从获自患有晚期疾病和癌转移的患者的活检样本识别。已研究针对存在于癌症患者的血浆和血清中可检测的循环核酸(DNA和RNA)以充当用于诊断性目的的标记物的潜在用途，其具有作为非侵入性诊断性工具的明显益处。已显示血浆内的标记物与在患者的致癌组织中所发现的标记物一致。由于RNA标记物与恶性肿瘤紧密关联，故用于早期检测癌症筛查的循环RNA尤其受关注。除癌症检测以外，存在于母体血浆中的胎儿特异性无细胞RNA的发现已打开关于产前分子诊断的新视野(参看例如潘等人,临床化学,46(11):1832-1834(2000)(Poonetal,ClinicalChemistry,46(11):1832-1834(2000)))。具体来说，血浆RNA的分析为胎儿的非侵入性基因表达解析带来希望。然而，迄今仅少数妊娠特异性无细胞RNA转录物已表征。尚未进行这类RNA的综合解析。分析非母体和母体血液中的无细胞RNA的一个问题为缺乏合适的数据来估计无细胞RNA存在的生物原因。例如，缺乏确定血液中所存在的无细胞RNA的组织来源的可靠方法。
技术实现思路
本专利技术提供解析无细胞RNA的来源以评估器官或组织的健康状况的方法。正常无细胞转录组中的偏离是在随着器官/组织开始衰竭或被免疫系统或病原体攻击使那些器官/组织特异性转录物大量释放到血液中时引起的。因此，发炎过程可作为身体对这些有害刺激的复杂生物反应的一部分而发生。根据某些方面，本专利技术利用健康个体的组织特异性RNA转录物推断在正常无细胞转录组中不同组织的相对最优比重，且样品的各个组织特异性RNA转录物指示所述组织的凋亡速率。正常无细胞转录组充当评估其他个体的组织健康状况的基线或参考含量。本专利技术包括样品的无细胞转录组与正常无细胞转录组的比较测量，用以评估在血浆中循环的组织特异性转录物的样品含量且用以评估对无细胞转录组起作用的组织的健康状况。除正常参考含量以外，本专利技术的方法还利用对其他患者群体具有特异性的无细胞转录组的参考含量。使用本专利技术的方法，人们可确定组织特异性转录物对母体个体、胎儿个体和/或患有病状或疾病的个体的无细胞转录组的相对比重。通过基于组织特异性转录物来分析组织的健康状况，本专利技术的方法有利地允许人们无需依赖于疾病相关蛋白质生物标记物而评估组织的健康状况。在某些方面，本专利技术的方法通过以下步骤评估组织的健康状况：比较生物样品中的RNA的样品含量与对组织具有特异性的RNA的参考含量，确定在样品含量与参考含量之间是否存在差值，且如果检测到差值则将组织表征为异常。例如，如果患者的特异性组织的RNA表达含量不同于正常无细胞转录组中的特异性组织的RNA表达含量，此指示患者的组织功能不正常。在某些方面，本专利技术的方法涉及通过如果血液中存在规定含量的RNA则将组织表征为异常来评估组织的健康状况。所述方法可进一步包括检测血液样品中的RNA的含量，比较RNA的样品含量与对组织具有特异性的RNA的参考含量，确定在样品含量与参考含量之间是否存在差值，且如果样品含量与参考含量相同则将组织表征为异常。本专利技术还提供综合解析母体血浆中的胎儿特异性无细胞RNA和使用与不同胎儿组织类型的相关比例来解卷积胎儿来源的无细胞转录组的方法。本专利技术的方法涉及使用下一代测序技术和/或微阵列表征在妊娠的不同阶段存在于母体血浆中的无细胞RNA转录物。这些转录物的定量允许人们推断在整个不同的妊娠期中这些基因的变化，且从而提供转录物中的时间变化的定量方式。本专利技术的方法实现针对妊娠期间或之后的并发症的可能性的诊断和识别。方法还实现依次阐明母体和胎儿发育程序的妊娠相关联转录物的识别。本专利技术的方法适用于早产诊断以及大体上与胎儿发育轨迹关联的转录谱的阐明。由此，本专利技术的方法适用于表征胎儿发育且不限于仅疾病病况或与妊娠关联的并发症的表征。所述方法的示例性实施例描述于实施方式、权利要求和下文提供的图中。附图说明图1描绘前面检测的女性妊娠相关联的差异性表达转录物的列表。图2显示在实例1中获得的无细胞RNA转录物含量的两个主要主成分的曲线。图3A描绘使用微阵列在早产和正常妊娠中展现不同时间含量的前100种无细胞转录物含量的热图。图3B描绘使用RNA测序在早产和正常妊娠中展现不同时间含量的前100种无细胞转录物含量的热图。图4描绘在早产与正常妊娠之间差异性表达的前20种转录物的排列。图5描绘关于图4的前20种常见RNA转录物的基因本体分析的结果，显示连接(整合或松散地结合)到质膜或连接在血小板的膜上的蛋白质的那些富集转录物。图6描绘在整个不同妊娠期中PVALB的基因表达谱显示相比于正常妊娠发现早产[以蓝色突出]具有较高的无细胞RNA转录物含量。图7概述确定占样品的无细胞转录组的相对组织比重的示例性方法步骤。图8描绘在实例2中产生的一组选定的胎儿组织特异性转录物。图9A和图9B描绘使用实际无细胞RNA以及相同无细胞RNA的cDNA库的胎儿组织特异性转录物的平行定量的原始数据，所述原始数据显示在整个母体时间点(早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后)的变化。图10说明整个母体时间点(早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后)中胎盘基因的相对表达量。图11说明整个母体时间点(早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后)中胎儿大脑基因的相对表达量。图12说明整个母体时间点(早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后)中胎儿肝脏基因的相对表达量。图13说明不同器官占血浆成人无细胞转录组的比重的相对组成。图14说明使用RNA测序数据得到的器官占血浆成人无细胞转录组的比重的分解。图15描绘使用定量聚合酶链反应(qPCR)验证的实例3中的一组94种组织特异性基因。图16显示图15的组织特异性转录物的热图，所述组织特异性转录物在无细胞RNA中可检测。图17描绘根据某些实施例的此方法的流程图。图18描绘使用来自人类U133A/GNF1H基因阿特拉斯(HumanU133A/GNF1HGeneAtlas)和RNA测序阿特拉斯(RNA-SeqAtlas)数据库的原始数据获得的实例3的组织特异性基因的列表。具体实施方式在此所描述的方法和材料应用下一代测序和微阵列技术的组合用于检测、定量和表征存在于生物样品中的RNA序列。在某些实施例中，生物样品含有来自不同基因组来源(即妊娠女性和胎儿)的基因材料的混合物。不同于其他以较小反应体积使样品中的核酸分离成标称单个目标分子的数字分析方法，本专利技术的方法在无需稀释或分散样品中的基因材料的情况下进行。本专利技术的方法允许多个转录组同时筛查，且提供各个转录物在单个核苷酸水平下的信息性序列信息，由此根据有限量的生物样品提供针对个体中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评估组织的健康状况的方法，所述方法包含检测生物样品中的RNA的样品含量；比较RNA的所述样品含量与对所述组织具有特异性的RNA的参考含量；确定在所述样品含量与所述参考含量之间是否存在差值；以及如果检测到差值则将所述组织表征为异常。

【技术特征摘要】
2012.01.27 US 61/591，6421.一种评估组织的健康状况的方法，所述方法包含检测生物样品中的RNA的样品含量；比较RNA的所述样品含量与对所述组织具有特异性的RNA的参考含量；确定在所述样品含量与所述参考含量之间是否存在差值；以及如果检测到差值则将所述组织表征为异常。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含监测所述组织以得到疾病进展的步骤。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考含量对应于所述组织在一个时间点的状态。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考含量为对于健康状态下的所述组织具有特异性的RNA的含量。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品为血液、血液组分、唾液、痰液、尿液、精液、经阴道体液、脑脊髓液、粪便、细胞或组织活检。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品为血液。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述RNA为无细胞RNA。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤是借助测序技术、微阵列技术或两者来进行。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述测序技术为全转录组鸟枪法测序。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考含量是通过计算机生成的数据库来确定。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织是选自由以下组成的组：全血、骨髓、下丘脑、平滑肌、肺脏、胸腺、淋巴结和甲状腺。12.一种评估组织的健康状况的方法，所述方法包含如果血液中存在规定含量的RNA则将所述组织表征为异常。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述组织是选自由以下组成的组：全血、骨髓、下丘脑、平滑肌、肺脏、胸腺、淋巴结和甲状腺。14.根据权利要求12所述的方法，其进一步包含检测血液样品中的RNA的含量；比较RNA的样品含量与对组织具有特异性的RNA的参考含量；确定在所述样品含量与所述参考含量之间是否存在差值，以及如果所述样品含量和所述参考含量相同则将所述组织表征为异常。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述参考含量指示疾病或病状。16.根据权利要求12所述的方法，其中所述RNA为无细胞RNA。17.根据权利要求12所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·C·W·蔻，S·R·魁克，HM·C·范，潘文英，
申请(专利权)人：利兰斯坦福青年大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US