一种多功能分层关节软骨支架的制备方法技术

本发明专利技术提出一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，以水凝胶为支架材料，以骨髓间充质干细胞、软骨细胞和成骨细胞为诱导、发育对象，采用3D打印技术来制备模拟天然软骨生物性能和机械性能的多功能分层关节软骨支架。本发明专利技术可以精确模拟天然软骨各个分层的内部组织形态和外形轮廓，实现不同的分层具有不同的力学和生物特性。所制备的人工软骨支架细胞来源于患者，支架为可降解水凝胶材料，大大减少了植入之后的排异反应。各种营养物质和生长因子混合在水凝胶支架中，还可以起到缓释的作用，实现对人工软骨生长发育的调控。

Preparation method of a multifunctional multi-layered articular cartilage scaffold

A multi-functional layered articular cartilage scaffold is prepared by using a hydrogel as the scaffold material, with bone marrow mesenchymal stem cells, chondrocytes and osteoblasts as the induction and development objects, and the multi-functional layered articular cartilage scaffold is prepared by 3D printing technology to simulate the biological and mechanical properties of natural cartilage. The invention can accurately simulate the internal tissue morphology and contour of each layer of natural cartilage, and realize that different layers have different mechanical and biological characteristics. Artificial cartilage scaffold cells derived from patients, scaffolds are biodegradable hydrogel materials, greatly reducing the rejection reaction after implantation. The mixture of various nutrients and growth factors in the hydrogel scaffold can also play a slow-release role in the growth and development of artificial cartilage.

【技术实现步骤摘要】
一种多功能分层关节软骨支架的制备方法
本专利技术属于软骨组织修复领域，具体涉及一种多功能分层关节软骨支架的制备方法。
技术介绍
关节软骨几乎没有自我修复的能力，软骨损伤往往是不可逆的，常会引起骨性关节炎，甚至危及生命。关节部位骨软骨复合组织缺损已经成为肢体残障的主要原因之一。目前主要采用植入替代物的方式治疗关节软骨病损，替代物主要包括自体或异体组织、人工软骨等等。其中自体或者异体组织存在来源受限、外形匹配困难等难题，而人工软骨由于其原料来源广，生物适应性好，有着广泛的发展空间。人工软骨有仿生材料和组织工程等制备方法，组织工程以其生物适应性好、可发育、可个性化定制等特点，代表了骨软骨修复未来的方向。在组织工程领域，人工软骨的制备已经有了广泛的研究。关节软骨生理结构特殊，由软骨层，软骨下骨层及其之间的钙化层三部分构成。软骨下骨层氧和营养含量丰富，而软骨层无血管、神经及淋巴，仅包含单一软骨细胞，并且处于低氧和低营养环境，其微环境的维持与他们之间致密的钙化层有关。钙化层厚度极薄，结构连接较紧密，组织致密，在软骨层和软骨下骨层之间起到了连接和缓冲作用。在钙化层和血管抑制因子的双重阻隔下，血管难以入侵软骨层，有效的防止了软骨内骨化。目前有多种方法用于人工软骨的制备，比较常用的是使用“支架+细胞”的方法制备出软骨支架，然后使用机械连接的方法将其固定到待修复部位。公开号为CN104399119A的专利公布了一种使用软骨干细胞和支架材料打印软骨组织的方法，该方法主要使用PCL作为支架材料，将含软骨干细胞凝胶的打印到PCL支架上，该方法可以实现细胞在软骨组织中的梯度分布，有较好的力学性能。但是该方法制备的软骨组织缺乏与硬骨组织的之间的过渡层，在软骨和硬骨的结合面产生了结构的突变，导致所制备的人工软骨难以同硬骨紧密的生长连接到一起；其次该方法制备的软骨组织采用单一干细胞分化发育的方式，同时由于缺乏与硬骨之间的过渡层，植入体内后，软骨层难以缺乏阻挡来自硬骨的血管入侵，血管的入侵会诱导骨髓间充质干细胞往硬骨的方向分化，导致软骨内骨化，丧失其功能。公开号为CN105435311A的专利公布了一种组织工程软骨复合支架及其制备方法。该方法使用可降解生物材料作为支架材料，并按照关节软骨的结构，制备出了多功能的分层人工软骨支架。该方法首先将支架材料和细胞混合，形成凝胶，然后将凝胶注入四氟乙烯模具，制备出具备特定形状的人工软骨。通过将不同的原料依次注入四氟乙烯模具，可制备出具有分层结构的人工软骨。该方法简单易行，在一定程度上实现了软骨的结构仿生。但是由于采用的是原料混合之后再浇铸成型的方法，导致支架中各层的成分分布均一，不能实现人工软骨中细胞密度的仿生分布。组织结构是发挥组织功能的基础，人工软骨不仅要能够模拟天然软骨的分层结构和内部细胞分布，还要能够在植入生物体后同周围的组织融合、生长到一起。这就要求所制备的软骨在结构上具有高的精度，在成分上具备高的仿生度。3D打印技术能够精准的复制天然软骨的结构，在人工软骨的制备上具备独天得厚的优势。
技术实现思路
为了克服现有技术制备的关节软骨难以同时具备精准的空间结构和生物性能的缺陷，本专利技术提出一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，以水凝胶为支架材料，以骨髓间充质干细胞、软骨细胞和成骨细胞为诱导、发育对象，采用3D打印技术来制备模拟天然软骨生物性能和机械性能的多功能分层关节软骨支架。本专利技术的技术方案为：所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：获取待打印软骨组织的三维模型，并分离出软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型；分别对软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型进行分层切片处理，其中软骨层分为N1层，钙化层分为N2层，软骨下骨层分为N3层，获取分层截面数据。步骤2：培养软骨细胞，获取细胞密度为5×106cells/ml～7×106cells/ml的软骨细胞悬液；培养骨髓间充质干细胞，制备细胞密度为4×106cells/ml～7×106cells/ml的骨髓间充质干细胞悬液；培养成骨细胞，获取细胞密度为3×106cells/ml～6×106cells/ml的成骨细胞悬液。这里控制悬液细胞密度为对应生物组织中细胞密度的110％-140％。申请人发现，如果简单的按照生物组织中细胞密度直接配置相应密度的细胞悬液，则会在打印过程中，因为需要打印大量的细胞悬浮液而增加打印时间，减小细胞存活率；所以需要在生物组织中细胞密度的基础上，提高一定密度来配置细胞悬液，但细胞密度又不能过高，实验发现，密度过高会增加细胞培养的难度，同时打印过程中造成一个液滴中含有多个细胞等问题，影响打印精度。步骤3：制备水凝胶支架基体材料H1组和H2组；基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶；H1组中海藻酸钠质量分数为2.5％～3.5％，明胶质量分数为0.8％～1.1％；H2组中海藻酸钠质量分数为4.5％～5.5％，明胶质量分数为1.1％～1.5％；并在水凝胶支架基体材料中加入质量分数为0.8％～1.2％的抗生素。这里对海藻酸钠的质量分数有特定的要求，其中海藻酸钠质量分数过高会造成溶液流动性差，难以挤压打印，还会缩小凝胶微孔直径，不利于细胞生存；海藻酸钠质量分数过低会造成打印的组织的强度低，弹性差，不满足软骨组织力学性能要求。当然，由于H1组和H2组分别用于制备不同的软骨结构，所以H1组和H2组中的海藻酸钠质量分数不同，但H1组和H2组中海藻酸钠质量分数不能超出各自限定的范围。步骤4：取H1组水凝胶支架基体材料，加入血管抑制因子，得到软骨层水凝胶支架材料，控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，逐层打印软骨层：步骤4.1：按照软骨层的分层截面数据打印一层软骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤4.2：将步骤2中制备的软骨细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；步骤4.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；步骤4.4：重复步骤4.1～步骤4.3，直到软骨层打印完毕。步骤5：取H2组水凝胶支架基体材料作为钙化层水凝胶支架材料；采用二氯甲烷与乙醇做溶剂，配置质量分数为3.5％～4.5％的PCL溶液作为静电纺丝材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤4打印完毕的软骨层上逐层打印钙化层；步骤5.1：按照钙化层的分层截面数据打印一层钙化层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤5.2：采用静电纺丝材料在固化后的钙化层水凝胶支架上制备一层纳米纤维层；步骤5.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液打印到纳米纤维层上；步骤5.4：重复步骤5.1～步骤5.3，直到钙化层打印完毕。步骤6：取H1组水凝胶支架基体材料，加入质量分数为2.5％～3.5％的纳米羟基磷灰石，加入血管内皮生长因子A、促进骨生成蛋白生长因子，得到软骨下骨层水凝胶支架材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤5打印完毕的钙化层上逐层打印软骨下骨层：步骤6.1：按照软骨下骨层的分层截面数据打印一层软骨下骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：获取待打印软骨组织的三维模型，并分离出软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型；分别对软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型进行分层切片处理，其中软骨层分为N1层，钙化层分为N2层，软骨下骨层分为N3层，获取分层截面数据；步骤2：培养软骨细胞，获取细胞密度为5×106cells/ml～7×106cells/ml的软骨细胞悬液；培养骨髓间充质干细胞，制备细胞密度为4×106cells/ml～7×106cells/ml的骨髓间充质干细胞悬液；培养成骨细胞，获取细胞密度为3×106cells/ml～6×106cells/ml的成骨细胞悬液；步骤3：制备水凝胶支架基体材料H1组和H2组；基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶；H1组中海藻酸钠质量分数为2.5％～3.5％，明胶质量分数为0.8％～1.1％；H2组中海藻酸钠质量分数为4.5％～5.5％，明胶质量分数为1.1％～1.5％；并在水凝胶支架基体材料中加入质量分数为0.8％～1.2％的抗生素；步骤4：取H1组水凝胶支架基体材料，加入血管抑制因子，得到软骨层水凝胶支架材料，控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，逐层打印软骨层：步骤4.1：按照软骨层的分层截面数据打印一层软骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤4.2：将步骤2中制备的软骨细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；步骤4.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；步骤4.4：重复步骤4.1～步骤4.3，直到软骨层打印完毕；步骤5：取H2组水凝胶支架基体材料作为钙化层水凝胶支架材料；采用二氯甲烷与乙醇做溶剂，配置质量分数为3.5％～4.5％的PCL溶液作为静电纺丝材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤4打印完毕的软骨层上逐层打印钙化层；步骤5.1：按照钙化层的分层截面数据打印一层钙化层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤5.2：采用静电纺丝材料在固化后的钙化层水凝胶支架上制备一层纳米纤维层；步骤5.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液打印到纳米纤维层上；步骤5.4：重复步骤5.1～步骤5.3，直到钙化层打印完毕；步骤6：取H1组水凝胶支架基体材料，加入质量分数为2.5％～3.5％的纳米羟基磷灰石，加入血管内皮生长因子A、促进骨生成蛋白生长因子，得到软骨下骨层水凝胶支架材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤5打印完毕的钙化层上逐层打印软骨下骨层：步骤6.1：按照软骨下骨层的分层截面数据打印一层软骨下骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤6.2：将步骤2中制备的成骨细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；步骤6.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；步骤6.4：重复步骤6.1～步骤6.3，直到软骨下骨层打印完毕；步骤7：将打印完成的软骨组织放入9.5％～10.5％FBS高糖培养基，移入36.8℃～37.2℃，6.8％～7.2％O2，4.9％～5.1％CO2的细胞培养箱中培养。...

【技术特征摘要】
1.一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：获取待打印软骨组织的三维模型，并分离出软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型；分别对软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型进行分层切片处理，其中软骨层分为N1层，钙化层分为N2层，软骨下骨层分为N3层，获取分层截面数据；步骤2：培养软骨细胞，获取细胞密度为5×106cells/ml～7×106cells/ml的软骨细胞悬液；培养骨髓间充质干细胞，制备细胞密度为4×106cells/ml～7×106cells/ml的骨髓间充质干细胞悬液；培养成骨细胞，获取细胞密度为3×106cells/ml～6×106cells/ml的成骨细胞悬液；步骤3：制备水凝胶支架基体材料H1组和H2组；基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶；H1组中海藻酸钠质量分数为2.5％～3.5％，明胶质量分数为0.8％～1.1％；H2组中海藻酸钠质量分数为4.5％～5.5％，明胶质量分数为1.1％～1.5％；并在水凝胶支架基体材料中加入质量分数为0.8％～1.2％的抗生素；步骤4：取H1组水凝胶支架基体材料，加入血管抑制因子，得到软骨层水凝胶支架材料，控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，逐层打印软骨层：步骤4.1：按照软骨层的分层截面数据打印一层软骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤4.2：将步骤2中制备的软骨细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；步骤4.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；步骤4.4：重复步骤4.1～步骤4.3，直到软骨层打印完毕；步骤5：取H2组水凝胶支架基体材料作为钙化层水凝胶支架材料；采用二氯甲烷与乙醇做溶剂，配置质量分数为3.5％～4.5％的PCL溶液作为静电纺丝材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤4打印完毕的软骨层上逐层打印钙化层；步骤5.1：按照钙化层的分层截面数据打印一层钙化层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤5.2：采用静电纺丝材料在固化后的钙化层水凝胶支架上制备一层纳米纤维层；步骤5.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液打印到纳米纤维层上；步骤5.4：重复步骤5.1～步骤5.3，直到钙化层打印完毕；步骤6：取H1组水凝胶支架基体材料，加入质量分数为2.5％～3.5％的纳米羟基磷灰石，加入血管内皮生长因子A、促进骨生成蛋白生长因子，得到软骨下骨层水凝胶支架材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪焰恩，国玉鸿，魏庆华，蔡显轩，宋瑶，王国伟，柴卫红，杨明明，张坤，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61