葫芦科中的非转基因单倍体诱导系制造技术

本发明专利技术涉及包含经修饰的CENH3基因的葫芦科的突变型植物，所述突变型植物当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。优选地，与在其它方面相同的天然存在的CENH3基因相比，经修饰的CENH3基因包含至少一个突变，所述至少一个突变导致编码的经修饰的CENH3蛋白的组蛋白折叠结构域中的至少一个非保守氨基酸变化或导致编码的经修饰的CENH3蛋白中出现提前终止密码子。本发明专利技术还涉及用于产生单倍体或双单倍体植物的方法以及由此获得的植物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】葫芦科中的非转基因单倍体诱导系本专利技术涉及可用作非转基因单倍体诱导系的葫芦科(Cucurbitaceae)的突变型植物。本专利技术还涉及所述植物的部分以及所述植物的后代。在植物育种中，主要目标是在单一基因组中尽可能多地组合所需性状，同时尽可能多地消除不想要的性状。这是一个缓慢的过程，需要许多个体品系的杂交，在几个生长季节期间评估此类杂交的结果，并选择有前景的后代进行进一步研究。通常选定的品系表现出一些非常好的特征(诸如，例如，较大的果实、耐旱性、抗病性、较快的萌发能力等)，但也有许多不被消费者和/或被植物种植者接受的次优性质。然后需要将选定品系的有趣特征引入商业上可接受的遗传背景中，而不丧失任何商业上重要的性状，最终得到纯种育种系，其中所有期望的性状都被遗传上固定。这种努力通常需要多代回交，因为遗传上不连锁的性状倾向于彼此分离，因此这是一个非常缓慢的过程。取决于物种的平均世代时间(从种子到种子)，新的植物品种的产生可能需要8至20年。纯育种品系可以例如用作杂交品种的亲本。将两个自交系(其基因组高度纯合)互相杂交，并且出售产生的杂交种子。杂交品系通常显示其亲本的优良特性的组合，并且由于其基因组的高杂合性(杂种优势)，它们通常优于它们的两个亲本。可以通过使用双单倍体(doubledhaploid,DH)品系来加速植物育种，该品系在一代内具有完全纯合的基因组。DH的一个重要有利方面是它们是能育的且可以无限地进行有性繁殖。DH可以通过例如雄核发育或雌核发育方案或通过使用单倍体诱导系统从植物的孢子产生。随后将这些单倍体植物的基因组加倍，这解释了它们为什么是完全纯合的。基因组加倍既可以自发发生，或可以通过添加有丝分裂阻断性的化学物质诸如秋水仙碱、氨磺乐灵或氟乐灵诱导。这导致形成双单倍体植物(DH植物，DH)，其能够产生种子。以这种方式，双单倍体系是永生化的。每个DH系代表来源于起始植物的亲本的性状的一种特定组合，其源于减数分裂期间所有遗传上不连锁的性状的改组。通过以下过程从起始植物的孢子产生DH：首先通过雄核发育诸如小孢子培养或花药培养，通过雌核发育，或通过诱导由受精事件产生的合子的母本或父本染色体的丧失来产生单倍体植物，然后使由此获得的单倍体植物的基因组加倍。技术人员非常熟悉产生DH的这些方法，并且他知道哪种方法在他喜欢的植物物种中效果最好。基因组加倍可以自发发生，或者其可通过应用化学物质诸如秋水仙碱、氨磺乐灵或氟乐灵来诱导。这些化学物质在有丝分裂期间破坏纺锤体的形成，并且通常用于阻断有丝分裂。由受精事件产生的合子的母本染色体的丧失可通过使用单倍体诱导系作为杂交中的雌性来诱导。已在各种植物物种中描述了单倍体诱导系统，例如当雌性杂交配偶体是与雄性杂交配偶体不同的物种的植物时。在种间杂交中，诸如在小麦与珍珠粟之间、大麦和球茎大麦之间以及烟草(红花烟草(Nicotianatabacum))与非洲烟草(Nicotianaafricana)之间的杂交中，经常观察到亲本之一的基因组的丧失。对于葫芦科家族成员，有DH的高效体外产生方案可供利用(参见，例如&Niemirowicz-Szczytt2013,FoliaHort.25:67-78；美国专利5,492,827)。然而，DH方案不适用于所有的基因型，并且几种类型的葫芦不适合于标准体外单倍体诱导技术。由于一直没有描述过导致亲本基因组之一的丧失的种间杂交，因此一直以来不可能体内获得DH。与体外方法相比，在体内产生DH具有明确的物流有利方面(logisticadvantages)：它不太费劳力，并且其不需要用于植物材料无菌培养的细胞生物学实验室或受控生长设施。因此，本专利技术的一个目的是提供用于属于葫芦科的植物的体内单倍体诱导系统。在文献中，已经描述了用于拟南芥的通过基因组消除获得单倍体植物的体内系统。该系统基于重组改变的CENH3(着丝粒组蛋白H3)多肽在具有相应的失活内源CENH3基因的植物中的转基因表达(MaruthachalamRavi和SimonWLChan；Haploidplantsproducedbycentromere-mediatedgenomeelimination；Nature464(2010),615-619；US-2011/0083202；WO2011/044132)。CENH3是作为动粒复合体一部分的着丝粒组蛋白，其在有丝分裂和减数分裂期间在染色体分离中发挥重要作用。CENH3由高度可变的N端尾部结构域和保守的组蛋白折叠结构域(HFD)组成。将拟南芥CENH3的N-末端尾部结构域与另一个组蛋白的N-末端尾部结构域交换并且同时融合至绿色荧光蛋白(GFP)导致其中表达该重组融合蛋白的拟南芥植物部分不育的情况。当与野生型拟南芥植物杂交时，表达该重组融合蛋白的亲本的染色体在胚发生过程中发生错误分离，导致相应的亲本基因组消除以及单倍体植物的产生，所述单倍体植物的染色体完全来源于野生型亲本。随后可如上所述实现基因组加倍。CENH3似乎是一个必需基因，因为拟南芥中的无效突变体显示胚致死性。然而，根据例如欧洲目前的法律，通过该方法产生的单倍体植物被认为是转基因的，具有转基因生物(GMO)身份，尽管它们本身不含转基因构建体。对于任何具有GMO身份的品系获得商业用途以及动物和/或人消费的批准，其需要经历广泛的监管程序，这是非常昂贵和耗时的。此外，在全球食品市场的重要部分，转基因食品不允许供人消费，也不受公众理解。因此，本专利技术的另一个目的是提供一种用于属于葫芦科的植物的体内单倍体诱导系统，其产生可在商业上出售而不需要监管批准的非转基因植物。在导致本专利技术的研究中，开发了在CENH3基因中具有单倍体诱导效应的新突变的葫芦科植物。令人惊讶地发现，当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时，这些新的突变体产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。因此，本专利技术提供了包含经修饰的CENH3基因的葫芦科的突变型植物，该突变型植物当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。本专利技术的突变型植物可以用作杂交的雌性亲本或雄性亲本，并且在两种情况下都可以获得单倍体后代。本专利技术还涉及植物的部分、种子和其它繁殖材料以及植物的后代。所述部分、种子、繁殖材料和后代在其基因组中包含所述突变。合适地，本专利技术的经修饰的CENH3基因不是天然存在的，并且其包含已经由人诱导的突变。可以通过本领域已知的许多方法将突变引入植物基因组的DNA序列中。随机诱变包括使用化合物来诱导突变(诸如甲磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、氨基甲酸乙酯、苯酚和环氧乙烷)，使用物理手段诱导突变(诸如紫外线照射、快中子暴露、X射线、γ照射)以及插入遗传元件(诸如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件)。还可通过同源重组、基于寡核苷酸的突变诱导、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统(诸如CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1)，以靶向、受控的方式引入突变。植物基因组中突变的存在可以通过现有技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含经修饰的CENH3基因的葫芦科的突变型植物，所述突变型植物当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.09 NL 20157531.一种包含经修饰的CENH3基因的葫芦科的突变型植物，所述突变型植物当与具有2n条染色体的野生型植物杂交时产生后代，其中至少0.1％具有n条染色体。2.权利要求1的突变型植物，其中与在其它方面相同的天然存在的CENH3基因相比，所述经修饰的CENH3基因包含至少一个突变，所述至少一个突变导致所述编码的经修饰的CENH3蛋白的组蛋白折叠结构域中的至少一个非保守氨基酸变化或导致所述编码的经修饰的CENH3蛋白中出现提前终止密码子。3.权利要求1或2的突变型植物，其中所述植物是黄瓜(Cucumissativus)植物，并且所述经修饰的CENH3基因编码对应于SEQIDNo:4或SEQIDNo:7的蛋白质。4.权利要求1或2的突变型植物，其中所述植物是甜瓜(Cucumismelo)植物，并且所述经修饰的CENH3基因编码对应于SEQIDNo...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·M·P·范邓恩，C·L·C·利弗尔特，S·莫瓦赫迪，
申请(专利权)人：瑞克斯旺种苗集团公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL