结直肠癌诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒技术

本发明专利技术公开了诊断、筛查与预测男性结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因RPS24转录起始点前后序列的如下三组CpG位点中第(1)组或者第(1)组与第(2)组或第(3)组组合发生甲基化：+22、+27和+29；(2)‑24、‑18、+89和+92；(3)+136，所述序列编号是基于SEQ ID NO.1中所示序列的编号，其中第143位转录起点开始的A为+1。本发明专利技术还公开了检测所述DNA甲基化标志物的探针、方法和试剂盒，以及利用上述DNA甲基化位点的数据预测男性结直肠癌发生风险的计算机模块。

Methods, markers and kit for diagnosis, screening and risk prediction of colorectal cancer

The present invention discloses DNA methylation markers for the diagnosis, screening and prediction of the occurrence of male colorectal cancer. The marker is the following three groups of CpG loci (1) or (1) and (2) or (3) groups of group (1) and (2) or (3) groups in the following sequence of the gene RPS24 transcriptional starting point: +22, +27 and +29; (2) 24, 18, +89 and +92; 3 +136, the serial number is based on the number of the sequence shown in SEQ ID NO.1, where the A starting from the 143rd bit transcription point is +1. The invention also discloses a probe, a method and a kit for detecting the DNA methylation markers, and a computer module for predicting the risk of male colorectal cancer by using the data of the DNA methylation site above.

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒
本专利技术涉及疾病检测领域；更具体而言，本专利技术涉及一种通过外周血细胞DNA甲基化检测进行结直肠癌诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒。
技术介绍
我国结直肠癌发病率和死亡率分别位居所有肿瘤发病率和死亡率的第5位，对于癌症，早期筛查的意义远超治疗。常规的结直肠癌诊断的金标准是肠镜，但创伤性，心理感受较痛苦，病人普遍比较抗拒；便潜血试验则需要多次采样，会给病人带来很多不便，从而造成受检者筛查意愿降低，依从性差。肿癌标志物的血液学检查，具有无创、采样方便的特点，可以大大提高受检者的依从性。如果能够有方法对结直肠癌的发生或复发风险进行评估，对于结直肠癌的防治而言，无疑更具意义。核糖体蛋白为核糖体重要组成部分之一，其在蛋白翻译过程中有重要作用。研究表明，核糖体蛋白异常能导致多种疾病的发生，如先天性再生障碍性贫血、肿瘤等，具体机制尚不清楚。
技术实现思路
专利技术人通过SequenomMassARRAY甲基化DNA定量分析技术研究结直肠癌患者外周血细胞RPS24基因甲基化水平与结直肠癌发生的关联，探讨其与结直肠癌发生、作为早期筛查标志物的应用前景。经过努力，发现了人的体液中基因RPS24转录起始点前后序列中的多个DNA甲基化位点与男性结直肠癌发生显著相关。因此，在第一方面，本专利技术提供了预测男性结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因RPS24转录起始点前后序列的如下三组CpG位点中第(1)组或者第(1)组与第(2)组或第(3)组组合发生甲基化：(1)+22、+27和+29；(2)-24、-18、+89和+92；(3)+136，所述序列编号是基于SEQIDNO.1中所示序列的编号，其中第143位转录起点开始的A为+1。在一个实施方案中，所述RPS24基因的核苷酸序列参见Genbank数据库(GeneID:6229)。在一个实施方案中，所述DNA甲基化标志物位于SEQIDNO.1所示的核苷酸区段中。在第二方面，本专利技术提供了用于检测本专利技术的DNA甲基化标志物的引物对，所述引物对扩增含有本专利技术第一方面中第(1)组；第(1)组和第(2)组；或第一组(1)和第(3)组的DNA甲基化标志物的序列。在一个实施方案中，所述引物对为扩增SEQIDNO.1的引物对。在一个实施方案中，所述引物对为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。在第三方面，本专利技术提供了一种检测本专利技术第一方面所述的DNA甲基化标志物的方法，所述方法包括1)提取DNA样品，2)对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理，3)用本专利技术第二方面所述的引物对扩增所述亚硫酸盐处理的样品，获得扩增产物，4)对所述扩增产物进行消化(例如采用SAP酶)，5)对所述消化后的扩增产物进行转录和酶切，6)采用质谱方法对所述转录和酶切产物进行检测，获得样品序列中本专利技术第一方面所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况。在一个实施方案中，在5)中包括对所述转录和酶切产物进行纯化。在一个实施方案中，所述质谱方法是飞行质谱方法。在第四方面，本专利技术提供了一种DNA甲基化标志物检测试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第二方面所述的引物对；所述试剂盒或者包括涵盖本专利技术第一方面中所述的甲基化位点的探针序列，其中本专利技术的CpG位点中的C保持不变或者被T替换。在第四方面，本专利技术提供了一种利用本专利技术第一方面所述DNA甲基化位点的数据预测男性结直肠癌发生风险的计算机模块，所述计算机模块包括：DNA甲基化值情况接收模块、数据存储模块、用于诊断、筛查与预测男性结直肠癌发生风险的处理器模块和用于输出结果的输出模块，其中，所述数据存储模块存储接收到的数据、本专利技术第一方面所述的CpG甲基化情况，所述用于预测男性结直肠癌发生风险的处理模块将所接收的DNA甲基化情况与本专利技术第一方面所述的CpG甲基化情况进行比较。在第五方面，本专利技术提供了一种利用本专利技术第一方面所述DNA甲基化标志物或者本专利技术第二所述的引物对用于男性癌症诊断、筛查与风险预测的用途，例如制备用于男性癌症诊断、筛查与风险预测的试剂的用途。在第六方面，本专利技术提供了一种采用基因芯片对基因组中序列为SEQIDNO.1的片段进行检测方法。优选地，所述检测包括对基因组中序列为SEQIDNO.1的片段进行CG位点进行甲基化情况的检测。本专利技术对基因RPS24转录起始点前后序列甲基化与男性结直肠癌之间的相关性进行评估，设计了一对引物，该引物扩增的DNA序列中覆盖了个DNA甲基化位点，利用此引物可对其中的DNA甲基化位点进行检测，评估男性结直肠癌的发生风险。本专利技术的方法有如下优点：1)本专利技术选择检测的甲基化位点分布于基因RPS24转录起始点前后序列上，与男性结直肠癌发生显著相关，可对男性发生结直肠癌的风险进行预测。2)本方法具有检测方便，成本低廉、高通量的特点，适合推广。附图说明图1：基因RPS24转录起始点前后序列检测区段甲基化水平对比图(结直肠癌组与对照组)图2：60例健康对照组RPS24基因检测区段甲基化水平男女对比图图3：男性结直肠癌组(24例)与男性健康对照组(23例)RPS24基因甲基化水平对比图图4：男性特异性直肠预测模型。具体实施方式人类核糖体蛋白S24(RPS24)基因包括6个外显子，其编码核糖体蛋白S24，是核糖体蛋白40s组成部分。已有体外细胞研究表明，RPS24基因异常表达与结直肠癌细胞增殖、转移相关，具体机制尚不清楚。本专利技术人发现了结直肠癌与基因RPS24第一外显子转录起始点前后序列的甲基化有关。专利技术人推测，基因RPS24可能是通过DNA甲基化调控基因表达，而这是导致结直肠癌发生的重要因素之一。本专利技术人发现，基因RPS24转录起始点前后序列如下位置CpG三组中，第(1)组以及第(1)组与第(2)组或第(3)组组合：(1)+22、+27和+29；(2)-24、-18、+89和+92；(3)+136(所述序列编号是基于SEQIDNO.1中所示序列的编号，其中第143位转录起点开始的A为+1)与男性结直肠癌发生有关，因此这些序列的甲基化位点可以作为男性预测结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，用于对癌症诊断、筛查与风险预测中，例如制备用于癌症诊断、筛查与风险预测的试剂。对于男性而言，第(1)组以及第(1)组与第(2)组区段甲基化水平显著高说明有结直肠癌组；这种情况并不适用于女性。不希望拘囿于任何理论，但专利技术人认为，这段序列的活跃程度决定了结直肠癌的发生。通过甲基化，恰当地阻断了有关基因的表达，从而避免结直肠癌发生。因此，这些序列的甲基化状态可以反映结直肠癌的情况。专利技术人通过实验数据证实了这一点。在本专利技术中，对于基因RPS24转录起始点前后序列的DNA序列编号基于SEQIDNO.1，其中第143位转录起点开始的A为+1。在本专利技术中，由于甲基化的CpG在经亚硫酸盐处理后C会变成U，所以利用其中本专利技术的CpG位点中的C保持不变或者被T替换的两种探针序列的杂交情况可以得出该CpG位点的甲基化情况。在本专利技术中，所述计算模块可以直接安装在检测设备上、手机app上、电脑软件上。例如，安装在便携设备中(例如可穿戴设备)，通过无线接收或者手动输入DNA甲基化位点的数据，通过计算从而实现远端预测男性结直肠癌发生风险。所述计算模块也可作为ap本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.男性结直肠癌诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因RPS24转录起始点前后序列中的如下三组CpG位点中第(1)组或者第(1)组与第(2)组或第(3)组组合发生甲基化：(1)+22、+27和+29；(2)‑24、‑18、+89和+92；(3)+136，所述序列编号是基于SEQ ID NO.1中所示序列的编号，其中第143位转录起点开始的A为+1。

【技术特征摘要】
1.男性结直肠癌诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因RPS24转录起始点前后序列中的如下三组CpG位点中第(1)组或者第(1)组与第(2)组或第(3)组组合发生甲基化：(1)+22、+27和+29；(2)-24、-18、+89和+92；(3)+136，所述序列编号是基于SEQIDNO.1中所示序列的编号，其中第143位转录起点开始的A为+1。2.用于检测权利要求1所述的DNA甲基化标志物的引物对，所述引物对扩增含有权利要求1或2中第(1)组；第(1)组和第(2)组；或第(1)组和第(3)组的DNA甲基化标志物的序列。3.根据权利要求1的引物对，所述引物对用于扩增SEQIDNO.1所示的核苷酸区段。4.根据权利要求2或3的引物对，所述引物对为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。5.检测权利要求1所述的DNA甲基化标志物的方法，所述方法包括1)提取DNA样品，2)对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理，3)用权利要求2-4任一项所述的引物对扩增所述亚硫酸盐处理的样品，获得扩增产物，4)对所述扩增产物进行消化(例如采用SAP酶)，5)对所述消化后的扩增产物进行转录和酶切，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴安东，刘长宁，宁争志，
申请(专利权)人：深圳市太科健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44