一株植物乳杆菌及一种冷冻干燥乳酸菌的方法技术

本申请公开了一株植物乳杆菌LP5，一种冷冻干燥乳酸菌的方法以及由所述方法制备的植物乳杆菌LP5菌粉。所述方法在对菌体进行真空冷冻干燥前，使用液氮使上机液迅速降温，从而最大限度减少乳酸菌菌体在真空冷冻过程中的细胞损伤，能够显著提高乳酸菌在常温条件下的贮藏稳定性，后期真空干燥直接进行辐射升温干燥，较传统方法更加节省能源。所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP5)菌粉，在常温条件下的贮藏稳定性显著提高，在25℃恒温条件下保藏360天，活菌存活率为75.0％以上。

A Lactobacillus plantarum and a freeze-dried lactic acid bacteria method

The invention discloses a Lactobacillus plantarum LP5, a method for freeze-drying lactic acid bacteria and a Lactobacillus plantarum LP5 powder prepared by the method. Before vacuum freeze drying, the method uses liquid nitrogen to cool the upper liquid rapidly, thus reducing the cell damage of the lactic acid bacteria in the vacuum freezing process to the maximum extent, and can significantly improve the storage stability of lactic acid bacteria under the condition of normal temperature. The system is more energy saving. The storage stability of Lactobacillus plantarum LP5 bacteria was increased significantly at normal temperature, and the survival rate of living bacteria was over 75% at 25 C under constant temperature for 360 days.

【技术实现步骤摘要】
一株植物乳杆菌及一种冷冻干燥乳酸菌的方法
本专利技术属于微生态制剂领域，具体涉及一株植物乳杆菌以及一种冷冻干燥乳酸菌的方法。
技术介绍
早在70年代，欧美一些发达国家相继开发研制新型微生态制剂，希望在一定程度上替代抗生素，并起到调节人体免疫力的效果。近些年，伴随我国消费者对微生态制剂认识的不断加深，乳酸菌微生态制以其调理胃肠道和提高免疫力方面的显著优势，越来越受到人们的关注。乳酸菌微生态制剂在投放市场前，通常经过真空冷冻干燥处理。但在实际的生产过程中，传统的真空冷冻干燥技术，在冷冻初期降温过程较为缓慢，由于细胞外部环境中存在多种溶剂以及无机盐，其中，冰点低的溶剂先结晶，冰点低的溶剂后结晶，而体系中的无机盐不结晶，这就导致细胞外部环境的液相浓度越来越大，逐渐转变为玻璃态，从而导致细胞外部环境的渗透压逐渐增大，进而导致细胞内的细胞质发生变化，并且，细胞间及细胞内的冰晶无规则排列，细胞间的压力直接作用在细胞质膜上，改变了细胞质膜的流动性以及其他物理和化学性质，还可能刺破细胞膜。这些因素综合导致细胞膜会遭受氧化损伤，使得乳酸菌自身对外界环境的抗性较差，生物活性逐渐丧失，从而导致乳酸菌固体食品货架期较短，严重制约乳酸菌系列产品的生产、销售和应用。因此，寻求一种可提高乳酸菌常温条件下贮藏稳定性的加工工艺已经迫在眉睫。
技术实现思路
本申请的目的之一是提供一株分离的植物乳杆菌LP5(LactobacillusplantarumLP5，L.plantarumLP5)。为达到上述目的，本申请是通过以下技术方案来实现的：植物乳杆菌(LactobacillusplantarumLP5，L.plantarumLP5)通过以下方法筛选得到：植物乳杆菌LP5分离自自然发酵的泡菜样品中，通过MRS固体培养基(DifcoTMLactobacilliMRSAgar)划线，于37℃，恒温培养48h，分离纯化得到的。经生理生化鉴定结合16srRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌LP5(LactobacillusplantarumLP5)，该菌株已于2017年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.13459；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏；保藏时间：2017年9月25日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本申请所分离的植物乳杆菌菌株(LactobacillusplantarumLP5)具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为25～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。本申请的目的之二是提供一种冷冻干燥乳酸菌的方法，所述方法包括：步骤1，将乳酸菌菌泥与水、小分子糖、蛋白质和除氧剂混合，搅拌，制得上机液；步骤2，使步骤1制备的上机液在10min内温度降至-50℃，保温；步骤3，将步骤2制备的体系置于-20℃环境中，在真空条件下按照程序升温进行冻干。本申请的目的之三是提供一种由所述方法制备的植物乳杆菌冻干剂，所述植物乳杆菌冻干剂中乳酸菌活菌数为4.6×1011CFU/g以上，在25℃恒温条件下保藏360天，活菌存活率为75.0％以上。本申请提供的冷冻干燥乳酸菌的方法显著不同于目前传统的隔板制冷技术，降温迅速且最大限度减少乳酸菌菌体在真空冷冻过程中的细胞损伤，能够显著提高乳酸菌在常温条件下的贮藏稳定性，后期真空干燥直接进行辐射升温干燥，较传统方法更加节省能源。采用本申请提供的方法制备的乳酸菌冻干粉，特别是采用本申请方法制备的植物乳杆菌(LactobacillusplantarumLP5)菌粉，在常温条件下的贮藏稳定性显著提高，在25℃恒温条件下保藏360天，活菌存活率为75.0％以上。具体实施方式植物乳杆菌(LactobacillusplantarumLP5，L.plantarumLP5)通过以下方法筛选得到：植物乳杆菌LP5分离自自然发酵的泡菜样品中，通过MRS固体培养基(DifcoTMLactobacilliMRSAgar)划线，于37℃，恒温培养48h，分离纯化得到的。经生理生化鉴定结合16srRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌LP5(LactobacillusplantarumLP5)，该菌株已于2017年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.13459；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏；保藏时间：2017年9月25日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本申请所分离的植物乳杆菌菌株(LactobacillusplantarumLP5)具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为25～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。本申请还提供一种冷冻干燥乳酸菌的方法，所述方法包括：步骤1，将乳酸菌菌泥与水、小分子糖、蛋白质和L-半胱氨酸盐、海藻酸钠和阿拉伯胶混合，搅拌，制得上机液。所述乳酸菌菌泥为植物乳杆菌菌株(LactobacillusplantarumLP5)的菌泥。所述菌泥中植物乳杆菌菌株(LactobacillusplantarumLP5)的活菌数为1×1010CFU/mL以上。在一种可实现的方式中，所述植物乳杆菌菌株(LactobacillusplantarumLP5)的菌泥可根据包括以下步骤的方法制备：步骤1-1，将冷冻保存的植物乳杆菌(LactobacillusplantarumLP5)接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养15h～25h，如20h。如此传代培养3次得到活化菌种。其中，MRS液体培养基按如下配比制备：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。可选地，所述植物乳杆菌LP5的接种量为2％(V/V)。步骤1-2，将步骤1-1制备的植物乳杆菌LP5按照5％(v/v)的比例接种到存有经过灭菌的MRS液体培养基的发酵罐中，37℃恒温培养，初始pH＝6.5，通过流加中和剂25％(V/V)氨水控制体系恒pH5.5，发酵3小时后，再停止控制恒pH进行发酵，当pH低于4.5时，再通过流加25％(V/V)氨水控制体系pH至5.5发酵5h，再进行自然发酵，如此循环控制20小时，至乳酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株分离的植物乳杆菌LP5(Lactobacillus plantarum LP5，L.plantarum LP5)，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCC No.13459。

【技术特征摘要】
1.一株分离的植物乳杆菌LP5(LactobacillusplantarumLP5，L.plantarumLP5)，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCCNo.13459。2.一种冷冻干燥乳酸菌的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1，将乳酸菌菌泥与水、小分子糖、蛋白质和除氧剂混合，搅拌，制得上机液；步骤2，使步骤1制备的上机液在10min内温度降至-45℃～-50℃，保温；步骤3，将步骤2制备的体系置于-20℃环境中，在真空条件下按照程序升温进行冻干。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌菌泥为植物乳杆菌LP5菌泥。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述小分子糖选自蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、果糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的一种或者多种，优选为蔗糖、葡萄糖和乳糖等重量比的组合物；所述蛋白质选自脱脂乳粉、大豆蛋白粉、脱盐乳清粉、酵母粉中的一种或者多种，优选为脱脂乳粉与酵母粉的组合物；所述除氧剂选自L-半胱氨酸盐、抗坏血酸钠、海藻酸钠和阿拉伯胶中的一种或者多种，优选为L-半胱氨酸盐。5.根据权利要求2至4任一项所述的方法，其特征在于，所述菌泥、水、小...

【专利技术属性】
技术研发人员：包维臣，张建军，姚国强，
申请(专利权)人：金华银河生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33