本发明专利技术公开了一种特异性引物对，所述特异性引物对的上游引物序列如SEQ No.1所示，下游引物序列如SEQ No.2所示。本发明专利技术还提供一种所述引物对在鉴定卷烟植物源性成分中的应用及其应用方法。所述方法包括提取待测食品卷烟总DNA，PCR扩增、克隆与测序、确定成分等步骤。利用本发明专利技术所述特异性引物对和PCR技术，能够快速、准确、灵敏地检测卷烟植物源性成分，并可在生产现场应用。
A specific primer pair for detecting plant source components in cigarette and its application
The invention discloses a specific primer pair, and the upstream primer sequence of the specific primer pair is shown as SEQ No.1, and the downstream primer sequence is shown as SEQ No.2. The invention also provides an application of the primer pair in identifying the plant derived components of cigarettes and an application method thereof. The method comprises the steps of extracting the total DNA, PCR amplification, cloning and sequencing, and determining the components of the food to be tested. The specific primer pairs and PCR technology of the invention can detect the plant source components of cigarettes quickly, accurately and sensitively, and can be applied in the production field.
【技术实现步骤摘要】
一种检测卷烟中植物源成分的特异性引物对及其应用
本专利技术属于遗传工程
，进一步属于卷烟成分分析
，具体涉及一种检测卷烟中植物源成分的特异性引物对及其应用。
技术介绍
在烟草是重要的经济作物，烟草中含生物碱约1%～9%及芸香苷、有机酸、脂肪、树脂、蛋白质、糖、香料等物质。在化工、农药和医药等领域有十分广泛的用途。烟草具有很强的生理活性，我国传统医药有许多利用烟草治病的记载。同时烟草行业也为国家缴纳了大量的利税，为国家的经济建设做出重要的贡献，尤其对偏远地区如云南，贵州等地区的发展做出的贡献更为突出。尤其是通过烟草的栽培种植可以极大的改善边远山区农民的收入，能够使社会保持稳定。因为利益驱动，目前市场上存在大量的假烟，里面可能掺杂着其它的植物材料，极大的损害了消费者的身体健康，同时存在一些非法售卖私烟的行为，这些行为是违法的，也给国家税收造成重大的损失，目前需要一种有效的方法检测查获的制品里面是否含有烟草成份，一旦含有烟草成份，则说明该制品违反了烟草专卖法。目前烟草制品检验方式主要是感官检验和理化检验。这些传统鉴别方式主要凭借业内人士的经验积累，也存在着经验主义不能定性的缺点。随着科学技术的发展，分子生物学鉴定技术逐渐渗透到各个生物领域，但在烟草制品成份检测领域应用还很少。为此，本专利技术研发了一种利用分子生物学技术检测食品中植物源性成分的方法。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种特异性引物对，所述引物对上游引物的序列如SEQNo.1所示，下游引物的序列如SEQNo.2所示。本专利技术的第二目的在于提供一种所述特异性引物对在鉴定卷烟中植物源性成分中的应用。本专利技术的第三目的在于提供一种应用所述特异性引物对鉴定卷烟中植物源性成分的方法，所述方法包括如下步骤：（1）提取待测卷烟总DNA；（2）PCR扩增：以总DNA为模板，根据NCBI中所有的植物rbcl基因序列，设计通用引物，然后进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；（3）克隆与测序：将所述PCR产物插入重组载体，然后将所述重组载体转入大肠杆菌，扩繁后提取质粒，对质粒进行测序；（4）确定成分：将所述测序结果在NCBI上进行blast序列对比，确定所述食品中的植物源性成分。本专利技术的第四目的在于一种含有所述特异性引物对的植物源性成分检测试剂盒。附图说明图1TPS法提取上海和云南卷烟DNA；图中，M-分子量标记，SH-上海某品牌卷烟，YN-云南某品牌卷烟；图2上海和云南卷烟PCR扩增产物；图中，M-分子量标记，SH-上海某品牌卷烟，YN-云南某品牌卷烟。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所做的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的一种特异性引物对的上游引物的序列如SEQNo.1所示，下游引物的序列如SEQNo.2所示。所述通用引物可以应用于鉴定食品卷烟中植物源性成分，应用所述特异性引物对鉴定卷烟中植物源性成分的方法，包括如下步骤：（1）提取待测卷烟总DNA；（2）PCR扩增：以总DNA为模板，使用所述特异性引物对进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；（3）克隆与测序：将所述PCR产物插入重组载体，然后将所述重组载体转入大肠杆菌，扩繁后提取质粒，对质粒进行测序；（4）确定成分：将所述测序结果在NCBI上进行Blast序列对比，确定所述卷烟中的植物源性成分。其中，总DNA采用常规方法提取，如CTAB法或TPS法。作为本专利技术的一种优选，所述PCR扩增体系为50μL体系：DNA模板1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，5×buffer10μL，dNTP（10mmol/L）1μL,DNA聚合酶0.5μL，最后加ddH2O至50μL；PCR扩增反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s,30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。DNA聚合酶可以使用Phusion、EasyTaqPCRSuperMix等高保真酶。将获得的PCR产物插入重组载体，再转入大肠杆菌。将获得的大肠杆菌单克隆扩繁并提取质粒。具体步骤如下：将做好转化的菌落放到2mL的LB培养基溶液中37℃震荡培养过夜。将摇好的大肠杆菌菌液倒入2mL离心管中，然后在12000r/min的转数下离心2min。除去上清，留下沉淀。向离心管的沉淀中加入250μL的P1溶液，然后充分震荡。接下来向离心管中加入250μL的P2溶液，然后轻轻的震荡。然后向离心管中加入350μLN1溶液，上下翻转7-8次混合均匀，此步骤不要剧烈震荡，以免将质粒变成开环结构。将离心管在12000r/min下离心10min，然后将上清液小心的移入试剂盒自带的纯化柱中，然后将纯化柱放入离心机，在12000r/min下离心1min。弃去上清液相，然后在纯化柱上加入500μL的PE溶液，将纯化柱放入离心机在12000r/min下离心1min，重复上述步骤。弃去上清，将纯化柱在12000r/min下离心1min。此时将纯化柱重新放到一个新的离心管上，将纯化柱管口打开，静止5min，充分将滤膜晾干，以免乙醇污染。在滤膜上加30μL的水，然后静止1min，让质粒充分的溶解在水中。然后将纯化柱在12000r/min下离心1min。此时得到的液相即为质粒。所述测序的方法为Sanger法测序或高通量测序。然后利用GenBank或BOLD等数据库进行Blast分析。另外，可利用所述通用引物制成试剂盒，所述试剂盒可用于检测食品卷烟中的植物源性成分。本专利技术通过设计合成通用引物，采用PCR技术检测卷烟中植物源性成分。该使用方法快速、准确、灵敏，可在生产现场应用。实施例1:CTAB法提取卷烟总DNA选取上海和云南生产的两种卷烟进行检测。采用CTAB法提取两种卷烟的总DNA：称取0.2g十多香粉末，加入600µL的CTAB提取液（表1），研磨成匀浆；将匀浆液转入1.5mLEppendorf管，60℃～65℃水浴1h；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），颠倒混合；常温下，12000r/min离心15min；用枪小心将上清转移到新离心管中，注意不要吸动中间的蛋白质层；12000r/min,离心10min，将上清转移到新管中，仍旧要注意不要触动中间的蛋白质层；向上清中加入0.6倍至等体积异丙醇，彻底颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀；用玻璃棒或枪头挑出DNA沉淀，放到已经加入70％乙醇的1.5mLEppendorf管中，颠倒管子几次，以洗涤DNA，溶解其中含有的色素等物质；离心，倒出管中的酒精，并用枪将剩余的液体尽量吸净，真空浓缩仪干燥之后，向管中加入适量TE缓冲液溶解DNA。电泳检测提取的DNA（图1）。表1CTAB缓冲液配置方法实施例2：PCR扩增以获得的DNA为模板，加入设计的通用引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为50μL体系：DNA模板1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，5×buffer10μL，dNTP（10mmol/L）1μL,PhusionDNAPolymerase0.5μL，最后加ddH2O至50μL；PCR扩增反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性引物对，其特征在于，所述引物对上游引物的序列如SEQ No.1所示，下游引物的序列如SEQ No.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种特异性引物对，其特征在于，所述引物对上游引物的序列如SEQNo.1所示，下游引物的序列如SEQNo.2所示。2.一种权利要求1所述特异性引物对在鉴定卷烟中植物源性成分中的应用。3.一种应用权利要求1所述特异性引物对鉴定卷烟中植物源性成分的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）提取待测卷烟总DNA；（2）PCR扩增：以总DNA为模板，根据植物rbcl基因设计特异性引物，并进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；（3）克隆与测序：将所述PCR产物插入重组载体，然后将所述重组载体转入大肠杆菌，扩繁后提取质粒，对质粒进行测序；（4）确定成分：将所述测序结果在NCBI上进行blast序列对比，确定所述卷烟中的植物源性成分。4.根据权利要求1所述鉴定卷烟中植物源性成...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢贺，白戈，杨大海，姚恒，李永平，张谊寒，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53
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