CD40L-特异性TN3-衍生的支架及其使用方法技术

本发明专利技术提供了与CD40L特异性结合的基于生腱蛋白‑3FnIII结构域的支架。本发明专利技术进一步提供了具有针对该靶标的增加的亲和力的工程化变体。本发明专利技术还涉及作为预防剂、诊断剂、或治疗剂的工程化支架，特别是用于针对SLE以及其他自身免疫性疾病和病症的治疗用途。

CD40L- specific TN3- derived scaffolds and their use

The invention provides a scaffold based on the tendon protein 3FnIII domain specifically binding to CD40L. The invention further provides an engineering variant with increased affinity for the target. The invention also relates to engineering scaffolds, as prophylactic agents, diagnostic agents, or therapeutic agents, especially for the treatment of SLE and other autoimmune diseases and diseases.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CD40L-特异性TN3-衍生的支架及其使用方法相关申请的引用本申请包含部份涉及提交于2011年10月11日的美国临时申请号61/546,028，提交于2010年4月13日的美国临时申请号61/323,708；提交于2011年4月12日的国际申请号PCT/US2011/032184；提交于2011年4月12日的国际申请号PCT/US2011/032188；以及提交于2008年10月10日并且被公开为国际公开号WO2009/058379A2的PCT申请号PCT/US2008/012398的主题。将上面引用的每个申请通过引用以其全文结合在此。序列表的引用本申请通过引用结合以文本文件经由EFS-Web与本申请一起提交的序列表，该序列表题为“CD40L-101WO1_SL.txt”，创建于2012年10月3日，并且具有的大小为232千字节。专利技术背景专利
总体上，本专利技术涉及抗体模拟物领域，确切地涉及衍生自人类生腱蛋白C的第三纤连蛋白III型结构域的支架，这些支架对于例如产生具有新颖的结合特征的产品是有用的。具体地，本专利技术涉及CD40L-特异性Tn3支架、制造此类支架的方法、以及用于诊断和治疗系统性红斑狼疮以及其他自身免疫和/或炎性失调的使用方法。
技术介绍
本专利技术涉及与CD40L结合、对于例如治疗自身免疫和/或炎性失调有用的CD40L-特异性蛋白支架。能够与一种所希望的靶标表位特异性结合的生物分子作为治疗、研究、以及医学诊断工具是非常重要的。这类分子的一个熟知的实例是抗体。可以选择与几乎任何结构表位特异性结合并对其有亲和力的抗体。然而，经典的抗体是结构上复杂的异四聚体分子，这些分子在简单的真核系统中难于表达。因此，使用复杂的并且昂贵的哺乳动物细胞表达系统来产生大多数抗体。可以将具有相对确定的三维结构的蛋白质（通常被称为蛋白支架）用作试剂，用于设计工程化产品。此类支架有用的一个具体区域是抗体模拟物设计领域。抗体模拟物（即，小的非抗体蛋白治疗剂）利用抗体和抗体片段的优点（例如与靶标的高亲和力结合以及低的免疫原性和毒性），同时避免了一些不足：例如抗体片段凝集的趋势并且比全长IgG更不稳定。可以通过使用去除部分抗体的天然折叠而创建的抗体片段解决这些缺点。然而，当将被正常地埋于疏水环境（例如可变结构域与恒定结构域之间的界面）中的氨基酸残基暴露于溶剂时，这通常导致凝集。基于支架的抗体模拟物的一个实例是基于纤连蛋白III型结构域（FnIII）的结构，该结构域是一种广泛发现于跨门和蛋白质种类的结构域，例如发现于哺乳动物血液和结构蛋白中。衍生自人类生腱蛋白C的第三FnIII结构域的FnIII支架的设计和用途描述于PCT申请PCT/US2011/032184和PCT/US2011/032188中，将两者通过引用以其全文结合在此。CD40L是主要表达于激活的T细胞（包括Th0、Th1、以及Th2亚型）上的TNF分子家族的一个成员，并且形成与这一家族的其他成员类似的同源三聚体。此外，还发现CD40L表达于肥大细胞、以及激活的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上。CD40L与抗原呈递细胞（APC）上的CD40受体（CD40R）结合，取决于靶细胞类型，这导致许多效果。通常，CD40L起到共刺激分子的作用并且诱导与由该APC上的MHC分子刺激的T细胞受体有关的APC的激活。由CD40L通过CD40受体的信号传导启动一个级联事件，这导致带有CD40受体的细胞的激活和最优的CD4+T细胞初敏。更确切地说，CD40L与CD40受体之间的同种相互作用促进B细胞分化为抗体分泌细胞和记忆B细胞（Burkly（布克利），在Adv.Exp.Med.Bio.（实验医学和生物学进展）中，第489卷，D.M.Monroe（门罗），U.Hedner（郝德纳），M.R.Hoffman（霍夫曼），C.Negrier（尼格里尔），G.F.Savidge（赛维德格），和G.C.I.White（怀特），编辑Klower学术/全会出版社，2001，第135页）。额外地，CD40L与CD40受体之间的相互作用促进通过巨噬细胞和树突细胞的激活的细胞介导免疫以及自然杀伤细胞和细胞毒T淋巴细胞的产生（参见布克利，同上）。已经示出CD40L与CD40受体之间的相互作用在若干实验诱导的自身免疫性疾病中是重要的，例如胶原诱导性关节炎、实验性变应性脑脊髓炎、卵巢炎、结肠炎、药物诱导的狼疮性肾炎。确切地，已经示出以所有这些模型中的疾病诱导的都可以在给予抗原时用CD40L拮抗剂阻断。还已经在患有自发性自身免疫性疾病（包括胰岛素依赖性糖尿病）的动物模型中、连同在移植物抗宿主疾病、移植、肺纤维化、以及动脉硬化疾病模型中看到使用抗-CD40L拮抗剂的疾病阻断。已经示出经由CD40L阻断的CD40L/CD40R通路的破坏在许多自身免疫介导的疾病（例如但不局限于系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、多发性硬化症（MS）、炎症性肠病（IBD）以及同种异体移植排斥）中是有益的。例如，用抗-CD40L抗体的处理预防或改善胶原诱导性关节炎小鼠模型中的肾炎（Mohan（莫汉）等人J.Immuno.（免疫学杂志）154:1470）。额外地，抗-CD40L抗体在患有建立的肾炎的SNF1小鼠中保留肾脏功能。（Kalled（凯莱德）等人免疫学杂志160:2158）。在非人类和人类两者中，CD40L水平与临床疾病严重程度（即，炎症的减少）、以及靶组织的损害密切相关。SLE是一种进行性的并且有时是致命的自身免疫性疾病。狼疮的各异表现从皮疹和关节炎通过贫血和血小板减少到甚至精神病变化。已经有明显的证据示出在导致肾脏、皮肤、大脑疾病和血栓形成的炎性过程中涉及免疫系统的许多分支。SLE的一个特色特征是B细胞失去耐受性并且在患有这一疾病的患者中自身抗体是显著的。在狼疮性肾脏疾病中，抗双链DNA自身抗体可以形成抗体核小体复合物并且迁入肾脏的肾小球基底膜中。这些免疫复合物反过来激活补体，这可以引起肾小球肾炎。已经发现在患有SLE的患者中CD40R连同CD40L的表达是提高的。增加的共刺激信号可能导致发现于SLE中的病理性炎症应答。SLET细胞具有与对自身抗原降低的激活阈有关的自发增加的激活作用。此外，这些细胞对另外的抗原刺激具有低反应性、对细胞凋亡具有抗性、在激活后具有增加的存活并且具有许多改变的细胞内信号传导通路。在由T细胞CD40L激活APC上的CD40R后，APC和T细胞两者都被激活，产生细胞因子并且在SLE中导致病原性自身抗体的产生和组织损伤（狼疮性肾炎）。单独地或组合地，CD40R/CD40L通路的阻断在阻断易发狼疮小鼠中的疾病中是有效的。在患有SLE的患者中，人源化抗-CD40L抗体减少抗双链DNA和B细胞、蛋白尿，并且改善SLE疾病严重程度。然而，用传统的抗体靶向CD40L已经产生了显著的安全忧虑。例如，由于报道的血栓栓塞性并发症，在患有慢性难治的特发性血小板减少性紫癜（ITP）的患者中的抗-CD40L抗体5c8的研究被搁置（Davidson（戴维森）等人ArthRheu（类风湿关节炎），43:S271）。此外，用直接针对CD40L的替代性抗体的额外的尝试导致其他血栓形成相关的并发症（Davis（戴维斯）等人本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包括至少两个CD40L‑特异性单体亚单位的Tn3支架，其中该单体亚单位如SEQ ID NO:146所示，并且其中该Tn3支架与CD40L特异性结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.11 US 61/546,0281.一种包括至少两个CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架，其中该单体亚单位如SEQIDNO:146所示，并且其中该Tn3支架与CD40L特异性结合。2.如权利要求1所述的Tn3支架，其中所述CD40L-特异性单体亚单位是一前一后连接的。3.如权利要求1所述的Tn3支架，其中所述CD40L-特异性单体亚单位被直接连接。4.如权利要求1所述的Tn3支架，其中所述CD40L-特异性单体亚单位经由一个接头而连接。5.如权利要求4所述的Tn3支架，其中该接头包括一个肽接头。6.如权利要求5所述的Tn3支架，其中该肽接头是一个柔性肽接头。7.如权利要求6所述的Tn3支架，其中该肽接头序列为(GmX)n，其中：(a)X是丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、Leu(L)、异亮氨酸(I)、或缬氨酸(V)；(b)m和n是整数；(c)m是1、2、3或4；并且(d)n是1、2、3、4、5、6、或7。8.如权利要求7所述的Tn3支架，其中该肽接头序列如SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:142或SEQIDNO:143所示。9.如权利要求1-8中任一项所述的Tn3支架，其中至少一个CD40L-特异性单体亚单位与一个接头、或与一个异源部分结合。10.如权利要求9所述的Tn3支架，其中一个接头或一个异源部分被共轭至该支架的N端或C端。11.如权利要求9所述的Tn3支架，其中该接头包括一个肽接头。12.如权利要求11所述的Tn3支架，其中该肽接头是一个柔性肽接头。13.如权利要求12所述的Tn3支架，其中该肽接...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·科伊尔，M·巴卡，T·迪斯泰德，S·德拉比克，L·格林伯格，S·诺瓦拉，V·奥加尼西安，R·赫伯斯特，D·K·斯班赛，
申请(专利权)人：米迪缪尼有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US