本发明专利技术具体公开了一种hsa‑miRNA‑155‑5p(简称miR‑155)在制备抑制肠道病毒71型(简称EV71)药物中的用途。本发明专利技术利用分子生物学技术发现EV71感染细胞后，能使胞内的miR‑155表达升高。miR‑155可通过靶向磷脂酰肌醇网格蛋白装配蛋白PICALM，进而抑制EV71的复制。本发明专利技术的上述应用为诊断和治疗EV71引发的疾病如手足口病等提供理论和实验基础，可应用于治疗EV71感染的药物开发。
Application of hsa-miRNA-155-5p in the preparation of drugs inhibiting human enterovirus 71
The invention discloses a HSA miRNA 5p 155 (miR 155) for the preparation of a drug for inhibiting enterovirus type 71 (EV71). The present invention uses molecular biology technology to detect EV71 infected cells, which can increase the expression of miR - 155 in the cells. MiR 155 can inhibit the replication of EV71 by targeting phosphatidylinositol grid protein assembly protein PICALM. The application of the present invention provides a theoretical and experimental basis for the diagnosis and treatment of EV71 induced diseases such as hand foot and mouth disease, and can be applied to the development of drugs for the treatment of EV71 infection.
【技术实现步骤摘要】
hsa-miRNA-155-5p在制备抑制人肠道病毒71型药物中的应用
本专利技术涉及一种hsa-miRNA-155-5p(简称miR-155)用于制备抑制人肠道病毒71型(简称EV71)药物中的应用，属病毒学、分子生物学及生物医药领域。
技术介绍
肠道病毒71型(EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属的一员，是引起手足口病最主要的病原体之一。自1969年首次被分离出来，EV71病毒疫情在众多国家和地区大规模爆发，包括中国、日本、马来西亚、新加坡等。在中国，从2009年至2016年，中国每年约有200万例感染，高居丙类传染病之首。由于缺乏有效的抗EV71药物，每年均有患者引发重症手足口病死亡。microRNA(miRNA)是由18-25核苷酸组成的单链非编码小分子RNA。大量研究表明，miRNA能调控细胞的多种生物学过程，包括发育、增殖、分化、凋亡等，而且miRNA还与肿瘤发生、代谢性疾病、神经退化性疾病、病毒感染与复制、脂肪代谢、慢性炎症和自身免疫性疾病等多种疾病密切相关。B细胞集合簇(B-cellIntegrationCluster，BIC)基因，位于人类21染色体，在不同组织器官中表达不同，脑、肺、胸腺和睾丸中高表达。miR-155(miRBase数据库中的编号为MIMAT0000646)是bic转录产物，其作用范围较广，可作用于细胞不同阶段，如抑制造血系统髓系和红系细胞生成；通过MAPK途径参与炎症反应；miR-155与高血压及心血管疾病有相关性；同时，大量的研究表明miR-155与多种肿瘤的发生之间存在着紧密的关系。但miR-155在抑制EV71病毒复制的方面未见报道。
技术实现思路
本专利技术公开了hsa-miRNA-155-5p在制备抑制人肠道病毒71型药物中的应用。miR-155模拟体(miR-155mimic)能够抑制磷脂酰肌醇网格蛋白装配蛋白(PICALM)表达，抑制网格蛋白介导的细胞内吞作用，从而抑制肠道病毒71型的复制，为其治疗提供理论和实验基础，在制备相关抗EV71药物提供了新的靶点。本专利技术的有益效果体现在：(1)本专利技术中miR-155具有抑制EV71复制和减弱病毒感染力的功能，为重症手足口病的的临床治疗提供新的思路与方法。(2)本专利技术提供的miR-155能够通过靶向磷脂酰肌醇网格蛋白装配蛋白(PICALM)基因，抑制磷脂酰肌醇网格蛋白装配蛋白(PICALM)的表达，减少网格蛋白介导的细胞内吞，从而抑制肠道病毒71型的复制，将其应用于制备相关治疗药物中，具有重要意义。附图说明图1：EV71感染后，实时荧光定量PCR检测胞内miR-155的表达。图2：miR-155模拟体(miR-155mimic)能体外抑制EV71的复制。图2A、miR-155mimic转染至SK-N-SH细胞12h，24h，48h，72h后，实时荧光定量PCR检测细胞内miR-155的表达水平；图2B、miR-155mimic转染至SK-N-SH细胞后，TCID50检测EV71的病毒滴度；图2C、miR-155mimic转染至SK-N-SH细胞后，WesternBlot检测EV71的结构蛋白VP1；图2D、miR-155mimic转染至SK-N-SH细胞后，实时荧光定量PCR检测EV71的RNA水平。图3：miR-155的靶基因—picalm基因的验证。图3A、miR-155与picalm基因结合位点的示意图；图3B、双荧光素酶验证miRNA-155与靶基因picalm的结合。图4：miR-155模拟体靶向picalm基因抑制EV71复制。图5：EV71型手足口病患者的咽拭子中高表达miR-155。图6：miR-155激动剂(miR-155agomir)能体外抑制EV71的复制。图A、颅内注射miR-155agomir后，荧光定量PCR检测乳鼠脑组织中miR-155的表达；图B，向乳鼠颅内注射miR-155agomir后，EV71感染乳鼠，分离脑组织，分别提取总RNA和总蛋白，荧光定量PCR检测EV71RNA水平；图C、WesternBlot检测PICALM和病毒蛋白VP1的表达；图D、图C的灰度分析图。具体实施方式在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。所使用EV71病毒液来源于自行分离病毒株，分离鉴定方法参照LingxiangMao*,JingWu#,LiShen,JingYang,JianguoChen,HuaxiXu*.Enterovirus71transmissionbyexosomesestablishesaproductiveinfectioninhumanneuroblastomacells.VirusGenes,2016,52(2):189-194。实施例1：EV71感染上调胞内miR-155的表达神经母细胞瘤SK-N-SH细胞培养过夜，待融合度至70-80％时，吸走培养液，PBS洗一遍后弃去；加入MOI＝10的EV71病毒液，37℃孵育1.5小时后；弃去病毒液，PBS洗一遍后弃去；加入含有2％胎牛血清的DMEM培养液，36小时后，分别收集收集未感染和感染EV71的SK-N-SH细胞，提取总RNA，定量检测miR-155的表达水平，见图1。结果如图1所示：荧光定量结果显示，相比未感染病毒(control)的细胞，感染EV71后(EV71infection)的SK-N-SH细胞中miR-155表达明显升高，结果有统计学意义。实施例2：miR-155模拟体能体外抑制EV71的复制(1)miR-155mimic转染后提高胞内miR-155水平miRNAmimic是运用化学方法合成的双链RNA，能模拟细胞中内源性成熟miRNA的高水平表达，以增强内源性miRNA的调控作用，进行功能获得性(gain-of-function)研究。miR-155mimic和miRNA模拟体阴性对照(miR-mimic-NC)均由广州市锐博生物科技有限公司合成。将miR-155mimic和阴性对照miRNA(miR-mimic-NC)分别转染SK-N-SH细胞后，荧光定量PCR检测细胞内miR-155水平。(2)miR-155mimic转染后抑制EV71的复制转染miR-155mimic后，检测EV71的病毒滴度、VP1蛋白和病毒核酸。与转染miR-mimic-NC比较，验证miR-155mimic对EV71复制的调控作用。结果如图2所示：当miR-155mimic转染至SK-N-SH细胞12h，24h，48h，72h后，与miR-mimic-NC相比，细胞内miR-155的表达水平随着时间的增加而升高(图2A)；miR-155mimic转染至SK-N-SH细胞后，EV71的病毒滴度(图2B)，EV71的结构蛋白VP1(图2C)和EV71的RNA(图2D)均显著下降，结果有统计学意义，表明miR-155mimic能在体外显著抑制EV71的复制。实施例3：miR-155的靶基因—picalm基因的验证通过Targetscan，MiRBase等miRNA生物学预测软件预测出p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.hsa‑miRNA‑155‑5p在制备抑制人肠道病毒71型药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.hsa-miRNA-155-5p在...
【专利技术属性】
技术研发人员：茅凌翔，吴静，沈俐，顾佳奇，邹欣然，许化溪，王胜军，
申请(专利权)人：镇江市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。